铜损失减轻制造技术

本文提供了防止溶液中的铜损失的方法。所述溶液是包含铜(II)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。所述方法包括在过滤所述溶液之前和之后具有基本上相同量的可溶性铜。还提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(II)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。还提供了培养细胞或制造生物产物的方法，所述方法包括使用根据防止铜损失或制备所述培养基的所述方法所制备的培养基。进一步提供了根据所述方法制备的培养基和此类培养基的用途。用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】铜损失减轻
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年4月15日提交的美国临时专利申请号63/010532的优先权，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
[0003]本公开部分涉及防止溶液中的铜损失的方法。还提供了在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(II)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法。细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂可以是可获得的或通过这些方法获得。细胞可以在根据此类方法制备的培养基中培养，并且生物产物可以通过所述细胞制造。

技术介绍

[0004]细胞培养可用于产生产物(诸如重组蛋白)，或者实际上培养的细胞本身也可以是一种产物。细胞培养可以使用真核细胞，诸如哺乳动物细胞，或原核细胞，诸如细菌细胞。
[0005]细胞培养依赖于使用培养基在受控条件下支持和生长细胞。培养基和相关的饲料、补充剂或添加剂需要存在许多不同的组分才能成功进行细胞培养。可以支持重组蛋白的商业生产的用于动物细胞培养的化学成分确定的培养基(CDM)的开发是生物技术行业的一个重要里程碑。CDM消除了含有血清/裂解物的培养基中固有的可变性(Price PJ,Gregory EA.Relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement,In Vitro Cellular&Developmental Biology
‑
Plant,1982；18(6)，其通过引用整体并入本文)并且大大降低了外来因子的风险(van der Valk J,Mellor D,Brands R,等人,The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum
‑
free cell and tissue culture,Toxicology in Vitro.2004；18(1):1
‑
12，其通过引用整体并入本文)。在CDM之前，依靠血清或裂解物来递送细胞生长所需的一系列营养物和组分。
[0006]CDM提供了研究与未定义培养基(例如，含有血清或水解物)相关的培养基组分相互作用的机会。然而，含有血清/裂解物的培养基的一个优点是化合物通常已经是生物可用的形式。例如，铁虽然是许多细胞功能的重要辅助因子，但可能对细胞有毒。在未确定的培养基中，依靠生物螯合剂(诸如转铁蛋白)来递送铁且没有毒性(Bjare U.Serum
‑
free cell culture.Pharmacology&Therapeutics.1992；53(3):355
‑
374，其通过引用整体并入本文)。在CDM中，必须研究和实施非蛋白质螯合剂(诸如柠檬酸盐)以防止铁毒性。CDM通常含有大量组分，这些组分能以不一定显而易见的各种方式进行相互作用。CDM的成功实施需要了解组分如何化学相互作用以及如何将它们保持在生物可用的形式中。因此，了解组分如何相互作用对于获得最佳培养基和构成未限定培养基的补充剂也很重要。
[0007]因此，需要改进的制备细胞培养基、饲料和补充剂的方法，以减少由于组分之间的相互作用而引起的潜在问题。

技术实现思路

[0008]我们已经确定，在包含半胱氨酸的细胞培养基、饲料或添加剂中，在痕量金属催化
剂(主要是铜和铁)存在下容易发生半胱氨酸向胱氨酸的氧化。当铜催化半胱氨酸氧化时，它会转化为不溶性铜(I)形式。一旦没有半胱氨酸被氧化，铜通常会恢复为可溶形式。然而，如果在发生半胱氨酸氧化的同时溶液经过无菌过滤，则至少一部分铜通常会处于不溶形式并且将从培养基中去除，从而降低培养基中铜的含量。这是不希望的，因为铜是许多细胞培养物中所需的痕量金属，因此溶液中的铜损失意味着所得培养基将为任何培养的细胞提供比预期更少的铜。这通常会导致较低的生产率。因此，本公开的目的是在过滤期间最小化和/或避免铜从溶液(诸如细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂)中的损失。
[0009]在第一方面，本公开提供了一种防止溶液中的铜损失的方法。溶液是包含铜(II)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。方法包括在过滤所述溶液之前和之后具有基本上相同量的可溶性铜。
[0010]在一实施例中，使用包含至少指定水平的溶解氧(dO2)的溶液进行过滤。将氧气水平保持在至少指定水平可以迅速将铜(I)转化为可溶性铜(II)，从而防止大量不溶性铜(I)的积累。指定水平可以是至少约6％dO2的水平。指定水平可以是至少约8％dO2的水平，例如，至少约10％dO2的水平或至少约12％dO2的水平。可以使用包含至少约6％dO2的溶解氧(dO2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约8％dO2(例如至少约10％dO2的水平或至少约12％dO2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约6％dO2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约8％dO2(例如至少约10％dO2的水平或至少约12％dO2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约6％dO2至少约15分钟。
[0011]指定水平可以是至少约0.4mg/L dO2的水平，例如，至少约0.6mg/L dO2的水平或至少约0.8mg/L dO2的水平。可以使用包含至少约0.3mg/L dO2的溶解氧(dO2)水平的溶液进行过滤。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约0.4mg/L dO2(例如至少约0.6mg/L dO2的水平或至少约0.8mg/L dO2的水平)至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约0.3mg/L dO2至少约10分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约0.4mg/L dO2(例如至少约0.6mg/L dO2的水平或至少约0.8mg/L dO2的水平)至少约15分钟。方法可以进一步包括在开始过滤之前，将溶液的dO2水平保持在至少约0.3mg/L dO2至少约15分钟。
[0012]在一实施例中，通过向溶液供氧和/或优化过滤，将dO2水平至少保持在所需水平。所需水平可以是约6％dO2、约8％dO2、约10％dO2或约12％dO2。所需水平可以是约8％dO2。所需水平可以是约0.3mg/L dO2、约0.4mg/L dO2、约0.6mg/L dO2或约0.8mg/L dO2。所需水平可以是约0.4mg/L dO2。
[0013]供氧可以包括用包含氧气的气体对溶液进行喷射。供氧可以包括搅拌和/或混合溶液以增加溶液与包含氧气的气本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种防止溶液中的铜损失的方法，其中所述溶液是包含铜(II)和半胱氨酸的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂，其中所述方法包括在过滤所述溶液之前和之后具有基本上相同量的可溶性铜。2.根据权利要求1所述的方法，其中采用包含至少约6％dO2的溶解氧(dO2)水平、任选地至少约8％dO2的溶解氧(dO2)水平的所述溶液进行所述过滤。3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括在开始所述过滤之前，将所述溶液的dO2水平保持在至少约6％dO2(或至少约8％dO2)至少约10分钟。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述dO2水平通过以下方式保持在所需水平：a.向所述溶液供氧；和/或b.优化所述过滤。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述供氧包括：用包含氧气的气体喷射所述溶液；和/或搅拌或混合所述溶液以增加所述溶液与包含氧气的气体的接触。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述包含氧气的气体是大气。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中优化所述过滤包括增加过滤速率、过滤器大小和/或过滤器容量，以使过滤期间dO2水平不会下降至低于8％。8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述过滤在向所述溶液添加铜(II)的约24小时之内完成。9.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述过滤在向所述溶液添加铜(II)的约5小时、约1小时或约30分钟之内进行。10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述过滤以每分钟总体积的至少0.5％、任选地每分钟总体积的至少5％的速率进行。11.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括提供半胱氨酸溶液和铜(II)溶液；并且所述过滤包括分别过滤所述半胱氨酸溶液和所述铜(II)溶液，并且接着将所述过滤的半胱氨酸溶液和所述过滤的铜(II)溶液合并以形成所述细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述半胱氨酸溶液包含所述细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的除铜以外的至少大部分组分。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述半胱氨酸溶液包含所述细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的除铜和任选的铁以外的基本上全部组分。14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述铜(II)溶液中铜的浓度在约0.005μM至约1M的范围内。15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述过滤包括无菌过滤。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述无菌过滤包括使用孔径不超过约0.5μm、任选地不超过约0.2μm的过滤介质。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述无菌过滤包括使用孔径为至少约0.1μm的过滤介质。
18.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述半胱氨酸实质上作为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物提供。19.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中在向所述溶液添加所述铜(II)之前，所述半胱氨酸实质上被转化为不包含巯基基团的半胱氨酸衍生物。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物包含二硫化物或噻唑烷部分。21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物包含二硫化物。22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物包含噻唑烷部分。23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物选自由以下项组成的组：胱氨酸、4
‑
羧基
‑2‑
甲基噻唑烷
‑2‑
甲酸盐、S
‑
磺基半胱氨酸、S
‑
磺基半胱氨酰甘氨酸、半胱氨酸S
‑
连接的N
‑
乙酰葡萄糖胺(GlcNAC
‑
cys)、同型半胱氨酸、L
‑
半胱氨酸混合的二硫化物、L
‑
半胱氨酸混合的肽、S
‑
烷基化半胱氨酸、具有硫醇保护基团的半胱氨酸(例如FMOC保护的半胱氨酸)、2
‑
甲基
‑
1,3
‑
噻唑烷
‑
2,4
‑
二甲酸、2
‑
(2
‑
羧基乙基)21,3
‑
噻唑烷
‑
2,4
‑
二甲酸、还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH)、S
‑
磺基谷胱甘肽、S
‑
酰基
‑
GSH、S
‑
羧基
‑
L
‑
半胱氨酸、L
‑2‑
氧代噻唑烷
‑4‑
甲酸、2
‑
烷基
‑
噻唑烷
‑
4(R)
‑
甲酸、2
‑
芳基
‑
噻唑烷
‑
4(R)
‑
甲酸和基于碳水化合物的噻唑烷(例如D
‑
核糖
‑
L
‑
半胱氨酸)。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物包含胱氨酸。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述半胱氨酸衍生物包含4
‑
羧基
‑2‑
甲基噻唑烷
‑2‑
甲酸盐。26.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述铜呈铜(II)螯合物的形式。27.根据权利要求21所述的方法，其中所述螯合物包含选自以下项的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、新铜试剂、浴铜灵、D
‑
青霉胺、三亚乙基四胺(TETA)、二巯基丙醇(BAL)、8
‑
羟基喹啉、氯碘羟喹和5,7
‑
二氯
‑2‑
[(二甲基氨基)甲基]
‑8‑
喹啉醇(PBT2)。28.一种在不损失可溶性铜的情况下制备包含铜(II)、半胱氨酸和其他组分的细胞培养基、细胞培养饲料或细胞培养添加剂的方法，所述方法包括：提供包含半胱氨酸和其他组分的水溶液；提供包含含铜(II)的水溶液；分别过滤所述包含半胱氨酸和其他组分的水溶液和所述包含铜(II)的水溶液；和将过滤的溶液合并以提供所述细胞培养基、细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：