一种基于水凝胶的三维细胞培养支架及其制备方法技术

本发明专利技术属于组织工程支架技术领域，公开了一种基于水凝胶的三维细胞培养支架及其制备方法。一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，中间层为水凝胶，上下两层为高分子多孔膜，所述中间层与上下层通过化学键合连接，所述化学键合连接为双键连接、和/或氨基与醛基键合连接。多孔膜具有抗菌功能通过叠加，可制备五层或更多层的结构。本发明专利技术提供的多层结构的三维支架，可在强制对流的培养基环境中使用，操作适应性能更佳，便于用于大规模细胞培养，具有更接近真实状态的三维培养模式，能够更好维持细胞的特性，化学键合的多孔膜复合水凝胶材料能够增强其力学特性，弹性模量较水凝胶提高了14.86倍，较物理结合的PU

【技术实现步骤摘要】
一种基于水凝胶的三维细胞培养支架及其制备方法


[0001]本专利技术属组织工程支架
，具体涉及一种基于水凝胶的三维细胞培养支架及其制备方法。

技术介绍

[0002]细胞移植生物疗法用于治疗多种疾病是临床未来重要的治疗方式。在使用细胞进行治疗时，需要一定的细胞数量，由于细胞来源的数量有限，通常需要经过体外的大规模培养增殖，才能达到临床治疗需要的细胞数量，现有的培养方法，通常是对提取的细胞在体外的扩增与培养。
[0003]二维细胞培养是利用培养板、培养瓶或培养皿等培养细胞，二维细胞培养操作简单，显著降低了实验的复杂性和成本，所有细胞都处于同一平面上，确保了所有细胞在相同的培养条件下生长，包括气体交换、营养供应和废物清除，此外，细胞还易于控制、筛选和收集。但二维培养常发生细胞组织架构、机械和生物化学信号以及细胞与细胞之间信息交流的丢失，无法反映真实组织生理上的复杂性，影响细胞功能。
[0004]三维细胞培养通过细胞聚集建立细胞球或将细胞嵌入支架上或支架内来模拟真实组织的细胞外基质，从而在一定程度上模拟体内环境，在细胞增殖、分化、形态和功能方面有不同的表现。如在二维环境中细胞生长的初始速率很高，但当细胞开始融合，增殖便会停止。与二维环境相比，三维支架中的细胞生长持续时间更长。三维培养系统，根据产品是否为细胞提供支撑材料大体可分为两种类型：基于支架的培养体系和无支架的培养体系。
[0005]无支架三维细胞培养是指细胞自发聚集形成巨大细胞球体，无需外源性支架或基质。心脏来源的祖细胞进行无支架三维细胞培养，与二维培养相比，干细胞相关基因表达有所上调，氧化应激条件下细胞存活率更高。然而，球体培养仍具有一些明显的缺点。细胞球的功能性活动与其直径密切相关，球体中心的细胞仅依赖球体由外向内扩散的营养和氧气生存，可能由于缺乏氧气和营养供应而死亡。目前人们还无法精准控制球体的大小，对球体结构控制的缺乏、与天然组织的差异等难题，限制着细胞球作为三维组织模型的应用。
[0006]有支架的三维细胞培养是将细胞复合在三维支架上进行培养。支架分为三种：天然细胞外基质支架、天然材料支架和合成材料支架。天然细胞外基质支架的可用性相对较小，组织质量难以控制，天然组织结构本身的复杂性及细胞或组织对刺激的独立应答，使得技术依赖性较高。天然支架包括海藻酸盐、壳聚糖等，天然材料本身复杂的生化反应、质量不一致、不明确来源等属性限制了其应用。合成生物材料具有良好的可控性和降解性，精良的组成成分和物理特性，可操作性高，灵活度大，没有免疫方面的问题，但缺点是器官特异性结构和细胞类型特异性的相对缺乏。支架采用的类型通常为水凝胶或者多孔材料，多孔支架虽然是三维结构，但细胞仍然是以二维粘附的方式在支架内部的表面生长，水凝胶具有与三维培养的特性更接近的模式。
[0007]水凝胶支架仍然存在营养物质向支架内部扩散的问题，当水凝胶厚度支架超过一定尺度后，通常约为2mm，支架内部的细胞难以获得足够的养分；此外，水凝胶由于强度较
差，通常只能静置在培养装置内，或悬挂在无强制对流的培养装置内，这两种方式均限制了大规模培养的实施。同时这两种方式也不便进行相应的力学加载刺激，影响了体外细胞行为的研究效率。
[0008]因此，在传统三维培养支架的基础上，开发一种适于大规模培养，耐受培养基强制对流，且能进行力学加载刺激的三维细胞培养支架，对细胞的快速扩增、细胞活性及特性的维持具有重要的意义。

技术实现思路

[0009]针对以上现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的是提供一种基于水凝胶的三维细胞培养支架。
[0010]本专利技术的另一目的是提供上述基于水凝胶的三维细胞培养支架的制备方法。
[0011]本专利技术的另一目的是提供上述基于水凝胶的三维细胞培养支架的应用。
[0012]用于三维细胞培养的载体材料，材料具有层状结构，层状结构的中间是用于支持细胞载体再生的多孔水凝胶结构，水凝胶上下两端是具有一定孔径孔隙率的多孔高分子材料膜结构，水凝胶与高分子膜间通过化学键合结合在一起。
[0013]针对细胞三维培养，解决培养基强制对流用的细胞规模化三维培养的三维培养支架。
[0014]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术实现方案：
[0015]一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，所述三维细胞培养支架中间层为水凝胶，上下两层为高分子多孔膜，所述中间层与上下层通过化学键合连接。
[0016]优选地，所述三维细胞培养支架厚度为0.1～0.5mm，所述高分子多孔膜厚度为0.01～0.05mm，所述水凝胶厚度为0.05～0.2mm，更优选为0.08
‑
0.14mm；
[0017]所述高分子多孔膜的孔径为0.01μm
‑
500μm；
[0018]优选地，所述化学键合连接为双键连接、和/或氨基与醛基键合连接，通过叠加制备五层以上的三维细胞培养支架。
[0019]优选地，所述高分子多孔膜的组成为聚氨酯，聚己内酯，聚乳酸，聚乙醇酸的一种或两种以上，或者为双键修饰的聚氨酯，聚己内酯，聚乳酸，聚乙醇酸的一种或两种以上；所述上下两层多孔高分子膜相同或不同。
[0020]优选地，所述水凝胶为明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚乙烯醇的一种或两种以上的组合；
[0021]或者所述水凝胶为氨基、巯基、不饱和基团改性后的明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚乙烯醇的一种或两种以上的组合。
[0022]所述不饱和基团包括碳碳双键，碳碳三建，羰基，羧基，醛基。
[0023]优选地，所述高分子多孔膜组成为表面修饰有双键的多孔聚氨酯，所述水凝胶为侧基带有双键的聚乙烯醇。
[0024]优选地，在所述高分子多孔膜表面涂敷抗菌涂层，或在水凝胶中包埋抗菌成分；
[0025]优选地，所述抗菌涂层为季铵盐；
[0026]所述水凝胶中还添加短肽、生长因子或药物，所述短肽为RGD肽，所述生长因子是VEGF或bFGF，所述药物为DMOG和/或去铁胺DFO。
[0027]一种制备上述基于水凝胶的三维细胞培养支架的方法，包括如下步骤：
[0028](1)制备表面修饰有双键的多孔材料：制备10～15wt％的高分子多孔材料溶液，加入40～50％乙二胺，70
‑
90℃搅拌反应，造孔，得到修饰有氨基的多孔材料，浸入到体积分数为2～3％的GMA的乙醇溶液中，加入催化剂，搅拌反应12
‑
24h，超声清洗，干燥，得到表面修饰有双键的高分子多孔材料；
[0029](2)制备侧基带有双键的水凝胶：将水凝胶层原料溶解于DMSO中得到3
‑
10％w/v溶液，加入羟基含量2％的GMA，催化剂，60
‑
70℃搅拌反应12
‑
24h，洗去未反应的GMA，得到侧基带有双键的水凝胶；
[0030](3)化学键合：将步骤(1)表面修饰有双键的高分子多孔材料平铺在两片载玻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，所述三维细胞培养支架中间层为水凝胶，上下两层为高分子多孔膜，所述中间层与上下层通过化学键合连接。2.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，所述三维细胞培养支架厚度为0.1～0.5mm，所述高分子多孔膜厚度为0.01～0.05mm，所述水凝胶厚度为0.05～0.2mm；所述化学键合连接为双键连接、和/或氨基与醛基键合连接。3.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，所述高分子多孔膜的组成为聚氨酯，聚己内酯，聚乳酸，聚乙醇酸的一种或两种以上，或者为双键修饰的聚氨酯，聚己内酯，聚乳酸，聚乙醇酸的一种或两种以上，所述上下两层多孔高分子膜相同或不同。4.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，所述水凝胶为明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚乙烯醇的一种或两种以上的组合；或者所述水凝胶为氨基、巯基、不饱和基团改性后的明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚乙烯醇的一种或两种以上的组合。5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，所述高分子多孔膜组成为表面修饰有双键的多孔聚氨酯，所述水凝胶为侧基带有双键的聚乙烯醇。6.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶的三维细胞培养支架，其特征在于，在高分子多孔膜表面涂敷抗菌涂层，或在水凝胶中包埋抗菌成分。7.一种制备权利要求1所述基于水凝胶的三维细胞培养支架的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备表面修饰有双键的多孔材料：制备10～15wt％的高分子多孔材料溶液，加入40～50％乙二胺，70
‑
90℃搅拌反应，造孔，得到修饰有氨基的多孔材料，浸入到体积分数为2～3％的GMA的乙醇溶液中，加入催化剂，搅拌反应12
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24h后，超声清洗，干燥，得到表面修饰有双键的高分子多孔材料；(2)制备侧基带有双键的水凝胶：将水凝胶层原料溶解于DMSO中得到3
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10％w/v溶液，加入羟基含量2％的GMA，催化剂，60
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7...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刚，王智楚，邓艳芳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：