制备高唾液酸化免疫球蛋白的方法技术

本文公开了使IgG抗体半乳糖基化的方法；制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，例如使用固定化β1,4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备高唾液酸化免疫球蛋白的方法
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求2020年3月5日提交的美国临时申请序列号62/985,467和2020年5月19日提交的美国临时申请序列号63/026,805的权益。上述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及使IgG抗体半乳糖基化的方法；制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，例如使用固定化β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)；以及包含与固体载体结合的β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的多肽和包含多肽的组合物。

技术介绍

[0004]由人供体的混合血浆(例如，来自至少1,000个供体的混合血浆)制备的静脉内免疫球蛋白(IVIg)用于治疗各种炎性疾病。然而，IVIg制剂具有不同的限制，诸如功效可变、临床风险、高成本和供给有限。不同的IVIg制剂在临床上经常被当作可互换的产品，但众所周知，存在产品制剂的显著差异，这可影响在所选临床应用中的耐受性和活性。在当前的最大给药方案中，在许多情况下仅获得部分且不持续性的响应。此外，与高体积IVIg治疗相关联的长输注时间(4小时至6小时)会消耗输注中心的大量资源，并且不利地影响患者报告的结果，诸如生活的便利性和质量。
[0005]对Fc结构域唾液酸化的重要抗炎作用的鉴定已经呈现出开发更有效的免疫球蛋白疗法的机会。可商购获得的IVIg制剂通常在所存在的抗体的Fc结构域上表现出低水平的唾液酸化。具体地讲，它们在Fc区上表现出支链聚糖的低水平二唾液酸化。
[0006]Washburn等人(《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences),USA 112:E1297
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E1306(2015))描述了一种受控的唾液酸化工艺，以生成高度四
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Fc
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唾液酸化的IVIg，并且表明该工艺得到具有一致增强的抗炎活性的产物。

技术实现思路

[0007]本文描述了使IgG抗体半乳糖基化的方法，其包括：(a)提供IgG抗体的混合物；以及(b)将IgG抗体的混合物在反应混合物中温育，该反应混合物包含：多肽，该多肽包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分；和UDP
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Gal，从而产生半乳糖基化IgG抗体。
[0008]本文还描述了制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，其包括：(a)提供如本文所述产生的半乳糖基化IgG抗体；以及(b)将半乳糖基化IgG抗体在反应混合物中温育，该反应混合物包含：
[0009]多肽，该多肽包含人ST6Gal1或其酶活性部分；和CMP
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NANA，从而产生hsIgG。
[0010]在一些实施方案中，制备hsIgG的方法还包括：(c)将包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分的多肽从反应混合物中分离，从而产生再循环
利用的β4GalT1；以及重复步骤(a)
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(b)，其中该反应混合物中的β4GalT1是在步骤(c)中分离的β4GalT1。
[0011]本文还描述了制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，其包括(a)提供IgG抗体的混合物；(b)将IgG抗体的混合物在反应混合物中温育，该反应混合物包含：多肽，该多肽包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分；和UDP
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Gal，从而产生半乳糖基化IgG抗体；以及(c)将半乳糖基化IgG抗体在反应混合物中温育，该反应混合物包含：多肽，该多肽包含人ST6Gal1或其酶活性部分；和CMP
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NANA，从而产生hsIgG。
[0012]在一些实施方案中，制备hsIgG的方法还包括(d)将包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分的多肽从反应混合物中分离，从而产生再循环利用的β4GalT1；以及重复步骤(a)
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(c)，其中该反应混合物中的β4GalT1是在步骤(d)中分离的β4GalT1。
[0013]在一些实施方案中，在步骤(b)之后将与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)与半乳糖基化IgG抗体分离。
[0014]在一些实施方案中，人β4GalT1的酶活性部分包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，包含人β4GalT1的酶活性部分的多肽与具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、添加或减去的SEQ ID NO:37、38或39或其变体具有至少85％的同一性。
[0015]在一些实施方案中，人ST6Gal1或其酶活性部分包含SEQ ID NO:14。
[0016]在一些实施方案中，包含人β4GalT1的酶活性部分的多肽还包含亲和标签，其中亲和标签与固体载体连接。
[0017]在一些实施方案中，亲和标签是C端的。
[0018]在一些实施方案中，至少一个标签选自包括以下的组：聚组氨酸、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S
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转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、血细胞凝集素(HA)、Myc、链霉亲和素结合肽(SBP)、钙调蛋白标签、Spot
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tag、链霉亲和素标签、FLAG
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tag、生物素以及它们的组合。
[0019]在一些实施方案中，聚组氨酸标签包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个组氨酸。
[0020]在一些实施方案中，聚组氨酸标签包含7或8个组氨酸。
[0021]在一些实施方案中，固体载体是磁珠。
[0022]在一些实施方案中，IgG抗体包含从至少1000个供体中分离的IgG抗体。
[0023]在一些实施方案中，IgG抗体的至少70％w/w是IgG 1抗体。
[0024]在一些实施方案中，供体受试者的至少90％已经暴露于病毒。
[0025]在一些实施方案中，hsIgG制剂中IgG抗体上的支链聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。
[0026]在一些实施方案中，hsIgG制剂中IgG抗体的Fab结构域上的支链聚糖的至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc
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α2,6
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Gal末端键连接的唾液酸；并且hsIgG制剂中IgG抗体的Fc结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使IgG抗体半乳糖基化的方法，所述方法包括：(a)提供IgG抗体的混合物；以及(b)将所述IgG抗体的混合物在反应混合物中温育，所述反应混合物包含：多肽，所述多肽包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分；和UDP
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Gal，从而产生半乳糖基化IgG抗体。2.一种制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，所述方法包括：(a)提供通过根据权利要求1所述的方法产生的半乳糖基化IgG抗体；以及(b)将所述半乳糖基化IgG抗体在反应混合物中温育，所述反应混合物包含：多肽，所述多肽包含人ST6Gal1或其酶活性部分；和CMP
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NANA，从而产生hsIgG。3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括：(c)将包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分的所述多肽从所述反应混合物中分离，从而产生再循环利用的β4GalT1；以及重复步骤(a)
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(b)，其中所述反应混合物中的所述β4GalT1是在步骤(c)中分离的β4GalT1。4.一种制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，所述方法包括(a)提供IgG抗体的混合物，(b)将所述IgG抗体的混合物在反应混合物中温育，所述反应混合物包含：多肽，所述多肽包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分；和UDP
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Gal，从而产生半乳糖基化IgG抗体；以及(c)将所述半乳糖基化IgG抗体在反应混合物中温育，所述反应混合物包含：多肽，所述多肽包含人ST6Gal1或其酶活性部分；和CMP
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NANA，从而产生hsIgG。5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括：(d)将包含与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)的酶活性部分的所述多肽从所述反应混合物中分离，从而产生再循环利用的β4GalT1；以及重复步骤(a)
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(c)，其中所述反应混合物中的所述β4GalT1是在步骤(d)中分离的β4GalT1。6.根据权利要求1、3、4或5所述的方法，其中在步骤(b)之后将所述与固体载体结合的人β1,4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT1)与所述半乳糖基化IgG抗体分离。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述人β4GalT1的酶活性部分包含SEQ ID NO:8。8.根据权利要求7所述的方法，其中包含所述人β4GalT1的酶活性部分的所述多肽与具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、添加或减去的SEQ ID NO:37、38或39或其变体具有至少85％的同一性。9.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述人ST6Gal1或其酶活性部分包含SEQ ID NO:14。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中包含人β4GalT1的酶活性部分的所述多肽还包含亲和标签，其中所述亲和标签与所述固体载体连接。11.根据权利要求10中的一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：动量制药公司，
类型：发明
国别省市：