高唾液酸化IGG的制备和纯化制造技术

本发明专利技术描述了用于制备以及纯化高唾液酸化IgG的方法。化IgG的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高唾液酸化IGG的制备和纯化
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请序列号63/026,875的权益。上述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开涉及用于制备以及纯化高唾液酸化IgG的方法。

技术介绍

[0004]由人供体的混合血浆(例如，来自至少1,000个供体的混合血浆)制备的静脉内免疫球蛋白(IVIg)用于治疗各种炎性疾病。然而，IVIg制剂具有不同的限制，诸如功效可变、临床风险、高成本和供给有限。不同的IVIg制剂在临床上经常被当作可互换的产品，但众所周知，存在产品制剂的显著差异，这可影响在所选临床应用中的耐受性和活性。在当前的最大给药方案中，在许多情况下仅获得部分且不持续性的响应。另外，与高体积IVIg治疗相关联的长输注时间(4小时至6小时)会消耗输注中心的大量资源，并且会对患者报告的结果产生负面影响，诸如生活的便利性和生活质量。
[0005]对Fc结构域唾液酸化的重要抗炎作用的鉴定已经呈现出开发更有效的免疫球蛋白疗法的机会。可商购获得的IVIg制剂通常在所存在的抗体的Fc结构域上表现出低水平的唾液酸化。具体地讲，它们在Fc区上表现出支链聚糖的低水平二唾液酸化。
[0006]Washburn等人(Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，第112卷：第E1297
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E1306页(2015年))描述了一种受控的唾液酸化工艺，以产生高度四
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Fc
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唾液酸化IVIg，并且表明该工艺得到具有一致增强的抗炎活性的产物。

技术实现思路

[0007]因此，本文描述了用于制备免疫球蛋白G(IgG)的方法，该IgG具有非常高的Fc唾液酸化水平，特别是二唾液酸化(Asn297(EU编号)处的聚糖的α1，3分支和α1，6分支两者上的唾液酸化)。本文所述的方法可提供高唾液酸化IgG(hsIgG)，其中Fc结构域上大于70％的支链聚糖在两个分支上(即，在α1，3分支和α1，6分支上)均被唾液酸化。HsIgG含有IgG抗体(主要是IgG1抗体)的多种混合物。抗体的多样性很高。用于制备hsIgG的免疫球蛋白可以例如从人类混合血浆(例如，来自至少1,000至30,000个供体的混合血浆)获得。免疫球蛋白可以从IVIg获得，包括可商购获得的IVIg。HsIgG在Fc区上的支链聚糖上的唾液酸水平远高于IVIg。这产生在结构和活性两方面不同于IVIg的组合物。HsIgG可如WO2014/179601或Washburn等人(Proceedings of the National Academy of Sciences，USA第112卷：第E1297
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E1306页(2015年))中所述进行制备，两者均以引用方式并入本文。
[0008]本文描述了用于制备以及纯化hsIgG的改进方法。在一些实施方案中，这些方法产生未纯化的hsIgG组合物，可从该组合物中分离出纯化的hsIgG和用于产生制备hsIgG的酶两者。在一些情况下，可重复使用所分离的酶。
[0009]本文描述了产生纯化的高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，其中hsIgG上大于75％的支链Fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸，这些方法包括：(a)提供包含hsIgG以及ST6Gal或其酶活性部分的hsIgG组合物；(b)将该组合物稀释在约50mM、约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在结合hsIgG以及ST6Gal或其酶活性部分的条件下，将该缓冲抗体组合物施加到包括具有磺酸官能团的树脂的色谱柱；以及(d)从该柱选择性地洗脱IgG，从而产生纯化的hsIgG组合物，其中hsIgG上大于75％的支链Fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸。
[0010]在一些实施方案中，提供hsIgG组合物的步骤包括提供包含hsIgG的组合物，以及将该组合物以约1∶1稀释度稀释在5X PBS中。
[0011]在一些实施方案中，CEX柱包括具有SO3‑
官能团的树脂。
[0012]在一些实施方案中，选择性地洗脱hsIgG包括在包含约400mM或更多NaCl的缓冲液中进行洗脱。
[0013]在一些实施方案中，该缓冲液是约50mM和约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液。
[0014]在一些实施方案中，该方法不包含在进行步骤(c)之前的除(a)和(b)之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。
[0015]在一些实施方案中，该方法包括在步骤(c)之前的除步骤(a)和(b)之外的单个深层过滤步骤。
[0016]在一些实施方案中，该附加深层过滤步骤在步骤(a)与(c)之间进行。
[0017]在一些实施方案中，该方法不包括在进行步骤(c)之前的除单个深层过滤步骤之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。
[0018]在一些实施方案中，该方法包括在步骤(c)之前的病毒灭活步骤。
[0019]在一些实施方案中，步骤(c)中的施加通过1、2或3次施加间隔开。
[0020]在一些实施方案中，步骤(e)重复一次或多次。
[0021]在一些实施方案中，步骤(c)以为或约为1、2、3、4、5或6分钟的停留时间进行。
[0022]在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(e)之后的以下步骤中的一者或多者：(f)蓝色染料色谱，(g)DE垫过滤步骤，(h)深层过滤步骤，或(g)PS20掺入和过滤步骤。
[0023]在一些实施方案中，纯化的hsIgG组合物包含来自步骤(a)的组合物的80％、85％、90％或95％或更多量的未纯化的hsIgG。
[0024]在一些实施方案中，纯化的hsIgG组合物包含100ppm、90ppm、80ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm或30ppm或更少的ST6Gal或其酶活性部分。
[0025]本文还提供了产生纯化的高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，该方法包括：(a)提供包含hsIgG以及ST6Gal或其酶活性部分的hsIgG组合物，并且任选地淬灭该反应；(b)将该组合物稀释在适合与柱一起使用的缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在允许80％或更多的hsIgG流通但允许仅100ppm或更少的ST6或其酶活性部分流通的条件下，将该缓冲抗体组合物施加到蓝色染料柱，例如本文所述的蓝色柱，从而产生纯化的hsIgG。
[0026]在一些实施方案中，该蓝色染料色谱柱是Trisacryl Blue(TABS)柱，并且适合与柱一起使用的缓冲液是含有约800mM NaCl的约100mM、约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液。
[0027]在一些实施方案中，该蓝色染料色谱柱是Capto
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Blue或Capto
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Blue HS柱，并且缓冲液是含有约800mM N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生纯化的高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，其中所述hsIgG上大于75％的支链Fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸，所述方法包括：(a)提供包含hsIgG以及ST6Gal或其酶活性部分的hsIgG组合物；(b)将所述组合物稀释在约50mM、约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在结合所述hsIgG以及所述ST6Gal或其酶活性部分的条件下，将所述缓冲抗体组合物施加到包括具有磺酸官能团的树脂的色谱柱；以及(d)从所述柱选择性地洗脱所述IgG，从而产生纯化的hsIgG组合物，其中所述hsIgG上大于75％的所述支链Fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中提供hsIgG组合物的所述步骤包括提供包含hsIgG的组合物，以及将所述组合物以约1∶1稀释度稀释在5X PBS中。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述CEX柱包括具有SO3‑
官能团的树脂。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中选择性地洗脱所述hsIgG包括在包含约400mM或更多NaCl的缓冲液中进行洗脱。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述缓冲液是约50mM和约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除(a)和(b)之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的除步骤(a)和(b)之外的单个深层过滤步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述附加深层过滤步骤在步骤(a)与(c)之间进行。9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除所述单个深层过滤步骤之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的病毒灭活步骤。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述施加通过1、2或3次施加间隔开。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)重复一次或多次。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)以为或约为1、2、3、4、5或6分钟的停留时间进行。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在步骤(e)之后的以下步骤中的一者或多者：(f)蓝色染料色谱，(g)DE垫过滤步骤，(h)深层过滤步骤，或(g)PS20掺入和过滤步骤。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的hsIgG组合物包含来自步骤(a)的所述组合物的80％、85％、90％或95％或更多量的未纯化的hsIgG。16.在一些实施方案中，所述纯化的hsIgG组合物包含100ppm、90ppm、80ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm或30ppm或更少的ST6Gal或其酶活性部分。17.一种产生纯化的高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含hsIgG以及ST6Gal或其酶活性部分的hsIgG组合物；(b)将所述组合物稀释在适合与所述柱一起使用的缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在允许80％或更多的所述hsIgG流通但允许仅100ppm或更少的所述ST6或其酶活性部分流通的条件下，将所述缓冲抗体组合物施加到蓝色染料柱，例如本文所述的蓝色柱，从而产生纯化的hsIgG。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述蓝色染料色谱柱是Trisacryl Blue(TABS)柱，并且适合与所述柱一起使用的所述缓冲液是含有约800mM NaCl的约100mM、约pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述蓝色染料色谱柱是Capto
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Blue或Capto
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Blue HS柱，并且所述缓冲液是含有约800mM NaC1的约250mM、约pH 4.5的甘氨酸。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中提供hsIgG组合物的所述步骤包括提供包含hsIgG的组合物，以及将所述组合物以约1∶1稀释度稀释在5X PBS中。21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除(a)和(b)之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。22.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的除步骤(a)和(b)之外的单个深层过滤步骤。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述附加过滤步骤在步骤(a)与(c)之间进行。24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除所述单个深层过滤步骤之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的病毒灭活步骤。26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述施加通过1、2或3次施加间隔开。27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中步骤(c)以为或约为1、2、3、4、5或6分钟的停留时间进行。28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，还包括在步骤(e)之后的以下步骤中的一者或多者：(f)蓝色染料色谱，(g)DE垫过滤步骤，(h)深层过滤步骤，或(g)PS20掺入和过滤步骤。29.一种产生高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，所述方法包括：(a)提供hsIgG；(b)通过添加饱和硫酸铵溶液使所述hsIgG沉淀，从而产生沉淀的hsIgG溶液；以及(c)分离所述沉淀的hsIgG，从而产生纯化的hsIgG组合物。30.根据权利要求29所述的方法，其中分离所述沉淀的hsIgG包括过滤和/或离心。31.一种产生高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)在包含凸1，4
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半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分以及UDP
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Gal或其盐的反应混合物中孵育所述混合IgG抗体；以及
(c)在包含ST6Gal或其酶活性部分以及CMP
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NANA或其盐的反应混合物中孵育所述半乳糖基化IgG抗体；(d)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsIgG。32.一种制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)在包含β1，4
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半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP
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Gal或其盐、ST6Gal或其酶活性部分以及CMP
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NANA或其盐的反应混合物中孵育所述混合IgG抗体；以及(c)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsIgG，从而产生所述hsIgG制剂。33.一种制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)在包含凸1，4
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半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分以及UDP
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Gal或其盐的半乳糖基化反应混合物中孵育所述混合IgG抗体，从而产生半乳糖基化IgG抗体；(c)将ST6Gal或其酶活性部分以及CMP
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NANA或其盐添加到所述半乳糖基化反应混合物中，以产生唾液酸化反应混合物；(d)孵育所述唾液酸化反应混合物；以及(e)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsIgG，从而产生hsIgG。34.一种制备纯化的高唾液酸化IgG(hsIgG)组合物的方法，所述方法包括：(a)提供IgG抗体混合物；(b)在包含β1，4
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半乳糖基转移酶I(β4GalT)或其酶活性部分和UDP
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Gal的反应混合物中孵育所述IgG抗体混合物，以产生半乳糖基化IgG抗体；(c)在包含ST6Gal或其酶活性部分和CMP
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NANA的第二反应混合物中孵育所述半乳糖基化IgG抗体，以产生hsIgG混合物；(d)在结合IgG抗体的条件下将所述hsIgG混合物施加到蛋白质A柱；以及(e)从所述蛋白质A柱洗脱hsIgG。35.根据权利要求34所述的方法，还包括(f)使用三丙烯酰基蓝色柱进一步纯化步骤(e)中产生的所述hsIgG。36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中步骤(e)包括用包含甘氨酸的缓冲液洗脱所述hsIgG。37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中在步骤(d)与步骤(e)之间用乙酸盐缓冲液洗涤所述蛋白质A柱。38.根据权利要求35至37中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：动量制药公司，
类型：发明
国别省市：