一种CCR-2突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种CCR

【技术实现步骤摘要】
一种CCR
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2突变体及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种CCR
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2突变体、用于编码CCR
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2突变体的多核苷酸序列、包括多核苷酸的载体、包括载体的细胞、以及这种CCR
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2突变体的应用。

技术介绍

[0002]小神经胶质细胞被激活后，可极化为M1和M2两种表型。M1型会表达一系列炎症因子，从而导致神经元细胞凋亡、神经传导束断裂、血脑屏障损坏等；而M2型主要表达抗炎因子。调控小神经胶质细胞向M2型极化有助于清除脑部损伤。例如脑血肿、阿尔海默兹等。
[0003]脑血肿的自身清除主要通过三种途径：小神经胶质/巨噬细胞系统是脑出血的第一道防线，是介导血肿清除的主要吞噬系统；部分清道夫受体(如CD36、CD47、SRA等)参与胞吞作用，对维持脑内平衡和吞噬作用有很重要的意义，能进一步促进脑血肿的清除；此外，一些上游调节系统(如Nrf2、PPAR
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γ)也可间接促进脑血肿的清除。其中小神经胶质细胞在血肿的清除过程中起着关键性的作用，当脑血肿形成时，可促进死亡细胞和血液碎片被吞噬，从而促进脑血肿的清除。因此，针对脑血肿的第一道防线—小神经胶质细胞，调控小神经胶质细胞向M2型极化，有助于促进脑血肿的清除。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开了一种CCR
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2突变体，这种突变体可以提高与配体趋化因子2的结合，提高了小神经胶质细胞向M2型极化，有助于提高清除脑部损伤的。
[0005]本专利技术的第一个目的，公开一种CCR
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2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]第二个目的，公开一种多核苷酸序列，能够编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列，这种多核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示的。
[0007]第三个目的，公开一种载体，包括SEQ ID NO.3的多核苷酸序列。
[0008]第四个目的，公开一种细胞，包括本专利技术公开的载体。
[0009]第五个目的，公开一种制备权利本专利技术CCR
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2突变体蛋白的方法，包括以下步骤：
[0010](1)制备载体；
[0011](2)载体转化：取出感受态细胞，将载体质粒加入感受态细胞中，轻轻混合，冰上孵育；在42℃下热冲击静置加热，再冰浴；加入LB培养液，200rpm，37℃，振荡孵育；将菌液涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板上，37℃孵育过夜；
[0012](3)蛋白表达：挑选琼脂平板上的单菌落，接种于LB培养基中，200rpm，37℃，振荡培养过夜；扩大培养，200rpm，37℃，振荡培养至菌液OD600到达0.6
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0.8；加入终浓度为0.5mM的IPTG,低温振荡诱导；
[0013](4)裂解洗涤：收集IPTG诱导后的菌液，8000rpm，4℃，离心，收集沉淀；加B
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PER溶液，超声破碎，混匀重复裂解一次；离心，11500rpm，4℃，弃上清；加17ml Buffer1洗涤沉淀，超声，离心，11500rpm，4℃，弃上清；加17ml Buffer2超声；离心，11500rpm，4℃，弃上清；加17ml Buffer1超声；离心，11500rpm，4℃，25min，弃上清；
[0014](5)蛋白纯化：加DeB溶解沉淀，磁力搅拌或层析柜混悬过夜；离心，11500rpm，4℃，收集上清；过Ni柱层析纯化，收集纯化样品，用透析袋或者超滤管透析除去DeB，获得纯化蛋白。
[0015]第六个目的，公开一种组合物，包括本专利技术公开的CCR
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2突变体的蛋白。
[0016]第七个目的，公开本专利技术CCR
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2突变体的用途，用于清除脑部损伤。
[0017]进一步，脑部损伤包括脑血肿、阿尔兹海默症。优选的，脑部损伤包括脑血肿。
[0018]趋化因子受体
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2(CCR
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2)会在一些中枢神经系统疾病的小神经胶质细胞中表达，CCR
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2与配体趋化因子2(CCL2)结合后，可促使小神经胶质细胞向M1型转化。本专利技术公开的CCR
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2突变体阻断人体内CCL2
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CCR
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2信号通路，阻断了小神经胶质细胞向M1型转化，促进M1向M2型转化。本专利技术根据鼠源CCR
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2的序列定点突变得到了一种全新的重组蛋白序列，以pET
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22b为载体合成质粒，以BL21(DE3)为受体菌，制备得到纯化的CCR
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2突变体的蛋白，而且本专利技术公开的CCR
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2突变体的蛋白可有效清除脑部损伤，例如，脑血肿。
附图说明
[0019]图1重组蛋白的SDS
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PAGE分析图M1为蛋白分子量标准，PC1为胎牛血清蛋白(1μg)，PC2为胎牛血清蛋白(2μg)，NC为无诱导的细胞裂解液，1为16h、15℃诱导的细胞裂解液，2为4h、37℃诱导的细胞裂解液，NC1为无诱导的细胞裂解液上清液，3为16h、15℃诱导的细胞裂解液上清液，4为4h、37℃诱导的细胞裂解液上清液，NC2为无诱导的细胞裂解液沉淀，5为16h、15℃诱导的细胞裂解液沉淀，6为4h、37℃诱导的细胞裂解液沉淀。
[0020]图2Western Blot分析图，M2为WB marker，3为16h、15℃诱导的细胞裂解液上清液，4为4h、37℃诱导的细胞裂解液上清液，NC2为无诱导的细胞裂解液沉淀，5为16h、15℃诱导的细胞裂解液沉淀，6为4h、37℃诱导的细胞裂解液沉淀。
[0021]图3纯化后重组蛋白SDS
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PAGE分析，其中M为蛋白分子量标准，BSA为胎牛血清蛋白(2μg)，P为纯化后的重组蛋白样品。
[0022]图4为空白对照组大鼠脑部矢状面图。
[0023]图5为CCR
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2干预组大鼠脑部矢状面图。
[0024]图6为本专利技术突变体蛋白干预组大鼠脑部矢状面图。
[0025]图7为正常大鼠脑部矢状面图。
具体实施方式
[0026]以下描述用于揭露本专利技术以使本领域技术人员能够实现本专利技术。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本专利技术的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本专利技术的精神和范围的其他技术方案。
[0027]实施例1多核苷酸制备
[0028]以Rattus norvegicus chemokine receptor type 2(NBCI XM_039082059.1)为模板，如序列SEQ ID NO.1所示。
[0029]MEDSNMLPQFIHGILSTSHSLFPRSIQELDEGATTPYD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CCR
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2突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种多核苷酸序列，其特征在于：能够编码权利要求1所述的氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。3.一种载体，其特征在于：包括权利要求2所述的多核苷酸序列。4.一种细胞，其特征在于：包括权利要求3所述的载体。5.一种制备权利要求1所述CCR
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2突变体蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)载体的制备；(2)载体转化：取出感受态细胞，将载体质粒加入感受态细胞中，轻轻混合，冰上孵育；在42℃下热冲击静置加热，再冰浴；加入LB培养液，200rpm，37℃，振荡孵育；将菌液涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板上，37℃孵育过夜；(23)蛋白表达：挑选琼脂平板上的单菌落，接种于LB培养基中，200rpm，37℃，振荡培养过夜；扩大培养，200rpm，37℃，振荡培养至菌液OD600到达0.6
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐颖倩，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：