适用于大规模质粒DNA生产的纯化方法技术

本发明专利技术属于生物分离纯化领域，具体涉及一种适用于大规模质粒DNA生产的纯化方法。所述方法为以先以阴离子交换层析介质为固定相进行离子交换层析去除RNA、内毒素和大肠杆菌宿主蛋白等杂质，保留质粒；再进行亲和层析去除吸附超螺旋质粒和其他微量杂质得纯化DNA质粒。该方法将离子交换层析与亲和层析相结合用于质粒纯化，相较于传统纯化工艺时长短，成本低；无需凝胶过滤步骤，直接层析处理样品体积不受柱体积限制，仅与待纯化的质粒量有关，纯化同样体积的料液，层析介质用量仅为传统凝胶过滤层析介质的1/10及以下，工艺放大时所需层析柱直径较小，可节约成本。可节约成本。可节约成本。

【技术实现步骤摘要】
适用于大规模质粒DNA生产的纯化方法


[0001]本专利技术属于生物分离纯化领域，具体涉及一种适用于大规模质粒DNA生产的纯化方法。

技术介绍

[0002]目前市面常用的高纯度质粒DNA纯化方法为三步层析：凝胶过滤层析去除RNA、亲和层析超螺旋质粒选择性吸附、离子交换层析内毒素和其它杂质去除。
[0003]该法所涉凝胶过滤层析步骤中上样体积受层析柱体积和料液粘度约束，上样体积最多为柱体积的30％。工艺进一步放大时，所需层析柱直径较大、层析介质用量较多，成本较高。且凝胶过滤层析柱在使用过程中普遍存在流速偏低、易塌陷的现象，生产过程耗时相对较长、层析柱重装频率相对较高。由于原理限制，凝胶过滤层析仅能完成质粒捕获，无法去除比质粒分子大的杂质，也无法有效降低内毒素、大肠杆菌宿主蛋白、基因组等杂质水平。经第二步层析后，质粒纯度也相对较低，需要通过第三步离子交换层析进行精纯，但该步质粒DNA收率相对较低，以致工艺总收率相对偏低。
[0004]因此，开发成本低，耗时短的质粒DNA的纯化工艺十分有必要。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种用于质粒纯化的阴离子交换层析介质。
[0006]阴离子交换层析介质的分离原理：在特定的PH值环境中，质粒带负电，可与带正电的阴离子交换层析介质由电荷相互作用结合。通过改变缓冲液PH值或电导，利用不同分子电荷的差异，可分别解除结合而洗脱，实现分离效果。DEAE是二乙胺基乙基，为阴离子交换层析介质所带配体的一种，相对电荷较弱，适用于质粒纯化。
[0007]层析介质配基有琼脂糖、聚苯乙烯、交联聚甲基丙烯酸酯聚合物等，按不同的工艺需求与不同的配体结合。常规质粒纯化的介质为凝胶过滤层析介质，利用分子的大小实现分离。用于纯化时，收集组分为大于特定尺寸的分子，分辨率较离子交换层析低。
[0008]所述阴离子交换层析介质为：配体为DEAE(二乙胺基乙基)，配基为交联聚甲基丙烯酸酯聚合物小球。
[0009]进一步，所述配基密度为0.29-0.35mmol cl-1
/ml填料。
[0010]本专利技术目的在于还提供一种DEAE阴离子交换层析介质在质粒纯化中的应用。目前文献显示，DEAE目前只在蛋白纯化中有应用，在质粒纯化中未有相关的应用。
[0011]本专利技术目的在于还提供一种包含质粒的混合物纯化的方法。
[0012]所述方法为以前述的阴离子交换层析介质为固定相进行离子交换层析。前述的阴离子交换层析介质具体为：配体为DEAE(二乙胺基乙基)，配基为聚苯乙烯刚性微球。
[0013]进一步，所述配基密度为0.29-0.35mmol cl-1
/ml填料。
[0014]进一步，所述混合物包括RNA、质粒、内毒素、大肠杆菌基因组和大肠杆菌宿主蛋白。
[0015]进一步，所述方法具体为：将所述混合物上样至离子交换层析柱；上样结束后用平衡缓冲液冲洗层析柱冲洗3-5个柱体积直至275-285nm处吸收值降至近基线水平，不收集上样和洗柱过程的峰。用洗脱缓冲液进行洗脱，冲洗3-5个柱体积，收集该峰，至275-285nm处吸收值降至近基线水平时，停止收集。
[0016]进一步，所述平衡缓冲液冲为20-150mM MOPs和/或Tris和/或HEPES和/或PIPES，pH值为6.5-7.5。
[0017]进一步，所述洗脱缓冲液为为20-150mM MOPs和/或Tris和/或HEPES和/或PIPES，pH值为6.5-7.5。
[0018]进一步，所述离子交换层析的层析柱选择直径为26mm、50mm、100mm、200mm、600mm的，装柱高100-200mm。
[0019]具体地，所述离子交换层析是分离RNA、质粒、内毒素和大肠杆菌宿主蛋白，先是去除RNA、内毒素、大肠杆菌基因组和大肠杆菌宿主蛋白，保留质粒达到纯化的目的。
[0020]本专利技术目的在于提供一种大规模质粒DNA的纯化方法。
[0021]所述纯化方法包括以下步骤：(1)将原料利用前述的混合物纯化的方法进行处理收集洗脱液；(2)所述洗脱液经缓冲液置换后进经亲和层析进行处理得纯化质粒DNA。
[0022]进一步，步骤(1)中所述的原料进行预处理，所述预处理具体为：将初始料液进行碱裂解得料液，然后将所述料液用切向流超过滤系统，经100-500kD孔径的模包或中空纤维柱进行浓缩得浓缩料液，然后用pH值6.5-7.5的离子交换平衡缓冲液换液，换液倍数为浓缩料液体积的3-5倍。
[0023]进一步，步骤(2)中所述缓冲液为20-150mM MOPs和/或Tris和/或HEPES和/或PIPES，pH值为7.0-8.0。
[0024]进一步，所述离子交换平衡缓冲液换液为20-150mM MOPs、Tris、HEPES、PIPES。
[0025]进一步，步骤(2)中所述的纯化质粒DNA进行后处理，所述后处理具体为：将所述纯化质粒DNA使用孔径30-300kD的模包或中空纤维柱对洗脱峰收集组分进行浓缩换液，将缓冲液置换为低电导的磷酸盐缓冲液或TE缓冲液中，然后将换液后的质粒DNA溶液进行除菌过滤得药用质粒DNA。
[0026]进一步，步骤(2)所述亲和层析的层析介质为PlasmidSelect Xtra。
[0027]具体地，步骤(2)所述亲和层析主要去除吸附超螺旋质粒和其它微量的杂质。
[0028]本专利技术目的在于还提供一种适用于大规模质粒DNA生产的纯化方法，所述方法为：
[0029](1)将原料上样至离子交换层析柱；上样结束后用平衡缓冲液冲洗层析柱冲洗3-5个柱体积直至275-285nm处吸收值降至近基线水平，不收集上样和洗柱过程的峰。用洗脱缓冲液进行洗脱，冲洗3-5个柱体积，收集该峰，至275-285nm处吸收值降至近基线水平时，停止收集。
[0030](2)将所述洗脱液经缓冲液置换后进经亲和层析进行处理得纯化质粒DNA。
[0031](3)将所述纯化质粒DNA使用孔径30-300kD的模包或中空纤维柱对洗脱峰收集组分进行浓缩换液，将缓冲液置换为低电导的磷酸盐缓冲液或TE缓冲液中，然后将换液后的质粒DNA溶液进行除菌过滤得药用质粒DNA。
[0032]进一步，所述平衡缓冲液和洗脱缓冲液为20-150mM MOPs和/或Tris和/或HEPES和/或PIPES，pH值为7.0-8.0。
[0033]具体地，所述离子交换层析是分离RNA、质粒、内毒素和大肠杆菌宿主蛋白，先是去除RNA、内毒素大肠杆菌基因组和大肠杆菌宿主蛋白，保留质粒达到纯化的目的。
[0034]进一步，步骤(2)所述亲和层析的层析介质为PlasmidSelect Xtra。
[0035]本专利技术的有益效果在于：
[0036]本专利技术将离子交换层析与亲和层析相结合用于质粒纯化，相较于传统纯化工艺时长短，成本低。
[0037]本专利技术无需凝胶过滤步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于质粒纯化的阴离子交换层析介质，其特征在于，所述阴离子交换层析介质为：配体为DEAE(二乙胺基乙基)，配基为交联聚甲基丙烯酸酯聚合物小球。2.根据权利要求1所述的阴离子交换层析介质，其特征在于，所述配基密度为0.29-0.35mmol cl-1
/ml填料。3.DEAE阴离子交换层析介质在质粒纯化中的应用。4.包含质粒的混合物分离的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1或2所述的阴离子交换层析介质为固定相进行离子交换层析。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合物包括RNA、质粒、内毒素、大肠杆菌基因组和大肠杆菌宿主蛋白。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：将所述混合物上样至离子交换层析柱；上样结束后用平衡缓冲液冲洗层析柱冲洗3-5个柱体积直至275-285nm处吸收值降至近基线水平，不收集上样和洗柱过程的峰；用洗脱缓冲液进行洗脱，冲洗3-5个柱体积，收集该峰，至275-285nm处吸收值降至近基线水...

【专利技术属性】
技术研发人员：王戬，任秋雨，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：