一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用，所述方法包括：用甲醇和二甲基亚砜依次提取植物样本；合并提取液并进行检测。本发明专利技术所述的检测方法检测到的植物激素的种类多，准确度、精密度和灵敏度高，不需要进行柱富集或干燥浓缩步骤，所需的样本量少，操作更为简便，有效降低了人力、时间和资金成本，可用于植物样本或相关样本中34种植物激素的同时检测。时检测。时检测。

【技术实现步骤摘要】
一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分析化学
，涉及一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]植物激素在植物生长、发育以及对生物和非生物线索的反应中具有关键作用。每一类激素都具有特征性的生物学效应。为了了解植物激素对植物生长和发育的调节作用，需要在器官、细胞和亚细胞水平上准确有效地测量单个植物激素。多类激素的同时定量分析为定义加性、协同或拮抗激素活性和识别调节植物功能的激素网络提供了基础。
[0003]现有植物激素测定方法主要有放射免疫测定和酶联免疫吸附测定、HPLC测定法、GC
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MS测定法和LC
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MS测定法，对于放射免疫测定和酶联免疫吸附测定，其具有灵敏度高的特点，但其所需抗体的交叉反应性通常会导致这些方法的特异性和准确性降低。HPLC测定法容易受基质影响，在多种内源性植物激素测量中灵敏度和特异性受限。GC
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MS测定法已成功用于高灵敏度特异性鉴定和定量植物激素，但GC
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MS分析通常需要在分析之前进行萃取、纯化和化学衍生化等步骤，比较繁琐，耗时较长。LC
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MS测定法具有高的灵敏度、特异性、准确性和重现性，但是目前的检测方法只能达到同时检测几种或十几种植物激素，并不能同时全面反映更多植物激素的含量情况。
[0004]因此，在本领域中，期望开发一种能够一次性同时提取更多种植物激素，能够具有高的灵敏度和特异性并且步骤简单、耗时短的植物激素检测方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种植物激素的检测方法。本专利技术的方法能够一次性提取出20种以上植物激素，能够同时检测20种以上植物激素的有无以及具体含量，并且该方法的准确度、精确度和灵敏度高，步骤简单、耗时短。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]一方面，本专利技术提供一种植物激素的检测方法，所述方法使用甲醇和二甲基亚砜(DMSO)依次提取样本；合并提取液并进行检测。
[0008]植物激素在植物等样本中种类多且含量非常低，难以检测完全。本专利技术人通过大量实验研究了植物激素的提取方法，包括使用单一溶剂或混合溶剂进行单次提取，包括使用甲醇、乙醇、DMSO、甲酸水溶液、盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液、甲醇DMSO混合溶液等进行单次提取，其提取效果均不理想，进一步，专利技术人进行两步提取研究，意外发现：先用甲醇，再用DMSO对样本进行两次提取，再将两次的提取液合并进行检测可以检测到的植物激素的种类最多。如表2、表3、表4中，对不同的植物样本，均是使用甲醇和DMSO组合提取检出的植物激素种类最多，达到了28～33种。
[0009]一般本领域的技术人员可能会想到：相对于使用单一提取溶剂，用不同类别的溶剂进行多次提取，可以得到更多种类的化合物。然而，本专利技术人在使用甲醇溶液两次提取植
物样本与先使用水溶液提取再使用甲醇提取植物样本，分别合并提取液进行检测，二者检测到的植物激素的种类是相同的；但是，先使用甲醇，再使用DMSO却明显提高了检测到的植物激素的种类。可能是由于植物激素在甲醇和水中的溶解度没有明显差异，而在甲醇和DMSO中存在一定差异，某种或多种植物激素在甲醇中不溶或难溶，而在DMSO中是易溶的，具体原因仍有待进一步研究。
[0010]此外，值得注意的是，专利技术人发现必须先使用甲醇提取再使用DMSO提取样本；先用DMSO提取再使用甲醇提取的效果与前者是不同的，其提取物合并溶液中检测到的植物激素的种类明显低于先甲醇再DMSO提取条件下的(表2和表3)。或许是由于甲醇分子量小，对植物细胞的渗透性好，易进入细胞内使细胞中的酶失活，而这些酶是可能在提取过程使植物激素水解的，如植物体内的碱性磷酸酯酶会造成核苷酸型细胞分裂素的水解，则先使用甲醇减少了酶对植物激素的水解作用，使提取获得的植物激素种类更多。也有可能是由于先使用甲醇改变了植物细胞的渗透性，再使用DMSO提取时，DMSO更容易进入细胞内部，使细胞内部的激素更容易被DMSO溶解出来。也有可能是上述二者的共同作用，具体原因需要进一步研究。
[0011]在一些实施方式中，用甲醇和二甲基亚砜依次提取植物样本的具体步骤包括：
[0012](1)取植物样本，加入甲醇，恒温震荡，离心或过滤得提取液，并取滤渣备用；
[0013](2)向步骤(1)的滤渣中加入DMSO，恒温震荡，离心或过滤取提取液。
[0014]将步骤(1)和步骤(2)的提取液合并即得样本溶液。
[0015]优选地，在步骤(1)恒温震荡前加入内标，所述内标包括IAA
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D5(吲哚乙酸
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D5)和/或ABA
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D6(脱落酸
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D6)。
[0016]优选地，步骤(1)中恒温震荡为在20℃及以下(例如20℃、15℃、10℃、5℃等)震荡不少于3h(例如3h、5h、8h、10h等)；步骤(2)中恒温震荡为在20℃及以下(例如20℃、18℃等)震荡不少于2h(例如3h、5h、8h、10h等)。步骤(1)和步骤(2)中震荡的频率为1000～1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)。植物激素不稳定、易分解、对温度等条件比较敏感，如赤霉素类激素通常在偏酸性条件下才比较稳定；同时温度超过40℃就会发生快速分解。步骤(1)和步骤(2)中分别使用甲醇和DMSO提取，其中20℃以下的温度一般不低于提取溶剂的熔点，以防溶剂凝固成固体。提取温度、提取时间和震荡频率等均会影响提取效率和植物激素的稳定性，步骤(1)和步骤(2)的恒温震荡条件是由专利技术人通过大量实验优化获得的，在该条件下能提高提取效率同时最大程度的减小温度的影响。在一些实施方式中，样本为植物的茎、花、叶等较为疏松柔软的植物组织时，步骤(1)的震荡时间为3h即可；当植物样本为种子等较致密的植物组织时，可适当延长步骤(1)的时间，可为4h及以上；也可根据样本的不同，适当延长步骤(2)的提取时间。
[0017]优选地，所述样本为植物组织的冻干粉末；相对于20～400mg(例如20mg、50mg、80mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或400mg)的样本，所述甲醇的用量为800～1200μL(例如800μL、900μL、1000μL、1100μL或1200μL)；所述二甲基亚砜的用量为200～600μL(例如200μL、300μL、400μL、500μL或600μL)。
[0018]本专利技术的方法尤其适用于少量植物样本的提取，植物样本量可低至20～400mg，先使用800～1200μL甲醇再使用200～600μL的DMSO提取，可以获得更多种类和更高浓度的植物激素，因而可以直接取提取液进行检测，不需经过浓缩过程。在研究过程中，专利技术人为了
能检测更多的植物激素，曾本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物激素的检测方法，其特征在于，所述方法使用甲醇和二甲基亚砜依次提取样本；合并提取液并进行检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用甲醇和二甲基亚砜依次提取样本的具体步骤包括：(1)取样本，加入甲醇，恒温震荡提取，离心或过滤得提取液，并取滤渣备用；(2)向步骤(1)的滤渣中加入二甲基亚砜，恒温震荡，离心或过滤得提取液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)恒温震荡前加入内标，所述内标包括吲哚乙酸
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D5和脱落酸
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D6。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中恒温震荡为在20℃及以下震荡不少于3h；步骤(2)中恒温震荡为在20℃及以下震荡不少于2h；步骤(1)和步骤(2)中震荡的频率为1000rpm～1500rpm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为冻干粉末，相对于20～400mg的样本，所述甲醇的用量为800～1200μL；所述二甲基亚砜的用量为200～600μL。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物激素包括如下植物激素中的一种或至少两种的组合：茉莉酸甲酯、6
‑
苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚
‑3‑
乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1
‑
氨基环丙烷
‑1‑
羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N
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茉莉酸
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异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3
‑
吲哚甲酸、吲哚
‑3‑
甲醛或12
‑
氧代植物二烯酸。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物激素包括油菜素内酯。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测采用LC
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MS进行检测；LC
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MS的LC条件包括：采用ACQUITY UPLC CSH C
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色谱柱，进样量为2μL～5μL，柱温40℃；用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为2mM甲酸铵0.05％甲酸水，流动相B为0.05％甲酸甲醇；梯度洗脱条件包括：0～2min，10％流动相B；2～4min，10～30％流动相B；4～19min，30～95％流动相B；19～19.10min，95～10％流动相B；19.10～22min，10％流动相B，流速为0.25mL/min；LC
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MS的MS条件包括：采用电喷雾电离源，正离子模式下质谱电压4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi；负离子模式下质谱电压
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4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为植物组织的冻干粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳恒，徐英，徐斌，任建洪，
申请(专利权)人：苏州帕诺米克生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：