快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)取血浆样品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂，进行蛋白沉淀后，取得过滤液；(2)将亲水作用固相萃取板按照活化、平衡、将过滤液上样、淋洗、洗脱的步骤获得洗脱下来的洗脱液；(3)对步骤(2)洗脱下来的洗脱液进行LC

【技术实现步骤摘要】
快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法


[0001]本专利技术属于生物分析领域，具体涉及快速测定人血浆中麻痹性贝类毒素及河豚毒素类物质的检测方法。

技术介绍

[0002]河豚毒素类物质，主要包括河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)、11
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oxTTX、11
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deoxyTTX、11
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norTTX
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6(R)
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ol、11
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norTTX
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6(S)
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ol、4
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epiTTX、4,9
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anhydroTTX、5,6,11
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trideoxyTTX、4
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CysTTX、5
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deoxyTTX、5,11
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dideoxyTTX和6,11
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dideoxyTTX等。属于强毒性的非蛋白类的神经毒素，广泛存在于河豚鱼和一些两栖动物体内。TTX类物质的中毒的程度与其摄入量、摄入后的时间和中毒前的健康状况有关。作为一类强效毒素，可选择性的阻断钠离子(NaV)通道，如NaV1.1、NaV1.2、NaV1.3、NaV1.6和NaV1.7，这些通道广泛分布于人类的中枢和外周神经系统，通过阻断神经冲动的传导实现神经麻痹，被认为是很有前景的疼痛治疗药物。其中，研究最多的是TTX，有报道TTX对人的致死剂量估计为6～7μg/kg体重，在0.5μg/kg体重时血压就会有下降趋势。当TTX用于临床治疗时，其剂量远低于LD50(小鼠腹腔注射的LD50为8μg/kg)，目前临床试验报告的给药剂量为15
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90μg(60kg/人)，血液中Cmax约为1ng/mL。
[0003]麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish toxins，PSTs)是一组天然的毒性生物碱，主要包括：石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素(Neo
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Saxitoxin，neo
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STX)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoyl saxitoxin，dc
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STX)、漆沟藻毒素1～6(Gonyautoxin 1～6，GTX 1～6)、N
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磺酰氨甲酰漆沟藻毒素2(N
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Sulfocarbamoylgonyautoxin 2，C1)、N
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磺酰氨甲酰漆沟藻毒素3(N
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Sulfocarbamoylgonyautoxin 3，C2)、脱氨甲酰基漆沟藻毒素2(Decarbamoyl gonyautoxin 2，dc
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GTX 2)、脱氨甲酰基漆沟藻毒素3(Decarbamoyl gonyautoxin 3，dc
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GTX 3)等。主要来源于赤潮中的有毒藻类，其毒理与河豚毒素类物质相似，都可通过选择性阻断钠离子通道，导致神经麻痹，甚至呼吸瘫痪。PSTs使人的中毒范围在600～5000μM之间，致死剂量为3000～30000μM。根据基团的相似性可分为四类：氨基甲酸酯类毒素、N
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磺酰胺甲酰基类毒素、脱胺甲酰基类毒素和脱氧甲酰基类毒素。近年来发现其与TTX类物质常在贝类动物中被检出，因此，为了确保患者的安全，并了解药物浓度与疗效之间的关系，亟需一种灵敏、准确和可靠的检测方法同时监测人体血液中TTX类物质和PSTs的水平。
[0004]目前，测定TTX类物质和PSTs的方法有小鼠生物法、液相荧光法、酶联免疫吸附法和液相色谱
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串联质谱法等。然而，小鼠生物法需针对特定动物检测，且前处理繁琐，重复性差；液相荧光法虽然操作简便，但灵敏度低、专一性差。酶联免疫吸附法灵敏度高、特异性强，但前处理复杂，反应耗时长，操作难度较大。与前几种方法相比，液相色谱
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串联质谱法是最有优势的技术，它具有特异性好、灵敏度高的特点，可以更快速、精准的测定人血液中TTX类物质和PSTs的浓度，从而为临床诊断提供更高效、准确的判断依据。但该技术仍有很大挑战，主要在于前处理方法的富集效果不佳和去干扰能力差。
[0005]TTX类物质和PSTs均为强极性碱性物质，在传统的反相色谱柱上保留性差，质谱电离效率低。亲水作用液相色谱(HILIC)可以帮助解决这些问题，在LC
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MS中显示出较好的保留能力和电离效率。生物样品中共流出基质导致目标分析物离子抑制(基质效应)是定量检测血浆中这两类物质的另一个挑战。这类物质样品的制备最常用的技术是固相萃取(SPE)，基于TTX类物质和PSTs的结构特点，可能用到三种不同作用机制的填料，一种是阳离子交换萃取。因化合物结构中所带的正电荷基团与固定相的磺酸基团发生强烈的相互作用，使得目标分析物在SPE上被牢牢保留，只有盐酸等强酸才能将其洗脱，从SPE洗脱的样品需要溶剂蒸发和复溶去除强酸才能进入LC
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MS检测，这既耗时又费力，且通常因强酸的加入，可能会带来其它杂质。因此，强阳离子交换萃取技术目前很少用于此类物质的检测。另一种SPE材料是石墨化碳载体，这种材料利用反相吸附原理保留目标分析物，因化合物极性大，通常回收率不佳，主要原因还是在于固定相对其保留的能力有限以及基质分离不足引起的离子抑制。由于目标分析物的亲水性，亲水作用
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固相萃取(HILIC
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SPE)可作为第三种选择。HILIC
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SPE是利用亲水相互作用将亲水性的化合物保留在填料上再进行洗脱的过程，但是HILIC作用力不强，因此保留能力和去除杂质的能力也有限。为了同时满足回收率和去杂质效果，有人先后使用C18和HILIC两种SPE填料希望增加对这类物质的富集和除杂质，该方法包括两次SPE萃取过程，洗脱后的产物需90℃吹干，步骤耗时且较为复杂[Fong BM et al.Talanta.2011Jan 15；83(3):1030
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6.]。目前无可供使用的简便且准确灵敏的TTX类物质和PSTs的检测方法用于血浆样本的测定。
[0006]因此，本领域迫切需要简便、快速且准确灵敏的测定TTX类物质和PSTs的检测方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种简便、快速且准确灵敏的测定TTX类物质和PSTs的检测方法。
[0008]因此本专利技术考察了3种市售的HILIC
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SPE板(分别为硅羟基SPE、酰胺基SPE、多元羧酸SPE)，并创新了前处理试剂组成，改变TTX类物质和PSTs与HILIC
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SPE固定相的单一作用力，使得二者结合时具备了亲水作用和离子交换作用双重模式，该技术用于血浆样本的前处理，结合LC
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MS/MS检测血浆中TTX类物质和PSTs，方法的灵敏度佳、基质效应小、回收率高。
[000本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速测定人血浆中PSTs及TTX类物质的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取血浆样品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂，内含内标Arg
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N4，进行蛋白沉淀后，取得过滤液；(2)用甲醇活化、乙腈平衡亲水作用固相萃取板，将步骤(1)获得的过滤液上样至亲水作用固相萃取板后，用95％乙腈溶液淋洗一次，加入三氯乙酸
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乙腈溶液的洗脱液洗脱；(3)对步骤(2)洗脱下来的洗脱液进行LC
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MS/MS分析，测定PSTs及TTX类物质的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀剂中三氯乙酸的质量百分比浓度为0.5％
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10％，内标Arg
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15
N4的质量百分比浓度为0.1
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10ng/ml。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固相萃取板为含多元羧酸键合相、硅羟基键合相以及酰胺基键合相的亲水作用固相萃取板。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固相萃取板为含多元羧酸键合相的亲水作用固相萃取板。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中三氯乙酸
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乙腈溶液组成为：质量百分比浓度0.5％
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5％三氯乙酸，质量百分比浓度40％
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60％乙腈，其余水。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中三氯乙酸
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乙腈溶液组成为质量百分比浓度1％三氯乙酸，质量百分比浓度50％乙腈，其余水。7.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆优丽，梁艳，忻亮，刘罡一，昌薇，王伟，李水军，杨双双，张美微，姜凤丽，于凡，谷雨婷，余琛，
申请(专利权)人：上海市徐汇区中心医院，
类型：发明
国别省市：