【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于胰腺单细胞悬液制备工艺，涉及一种胰腺单细胞悬液的制备方法及其应用，具体涉及一种结团率低、细胞活率高、满足单细胞转录组测序的胰腺单细胞悬液的制备方法及其应用。
技术介绍
1、单细胞转录组测序技术即在单个细胞水平上，对转录组进行高通量测序分析，其让研究人员能够获取之前经常会被大量细胞的rna-seq方法所掩盖的关键数据，如罕见或新的细胞类型，从而在单细胞水平上探索基因表达多样性。该技术能实现大规模的单细胞转录组测序，具有细胞通量高、细胞捕获率高、项目周期短等优点，并广泛应用于细胞异质性、免疫细胞群体检测及构建细胞图谱等研究。
2、单细胞样本制备是单细胞转录组测序技术中极其关键的一环，也是单细胞转录组测序技术首先需要解决的问题。胰腺单细胞转录测序对糖尿病、胰腺炎等相关疾病的病理机制研究、诊断、治疗等都具有重要意义。然而，胰腺是一个较为特殊的器官，其中的大部分细胞均为外分泌腺泡细胞，该细胞包含有大量的消化酶类。在分离制备胰腺单细胞悬液过程中，在常温下或体温下进行消化，外泌体细胞中的消化酶类会使胰腺细胞破碎死亡，释放出大量dna缠绕粘连成团，进而使杂质碎片过多、细胞数量过少，胰腺细胞分离纯化失败，无法获得符合单细胞测序要求的胰腺单细胞悬液。
3、cn101705206a公开了一种分离制备小鼠胰腺单细胞悬液的方法，包括小鼠胰腺取材、胰酶冷消化、胰腺单细胞分离与纯化等步骤。该专利技术利用胰酶在低温低活力状况下浸入胰腺组织，然后再通过短时温消化解离胰腺组织，从而获得高数量、高纯度、高活力、无粘连的胰腺单细胞
4、现有技术已公开的胰腺单细胞悬液的制备工艺耗时相对长、操作相对复杂，或者在提高细胞活率、降低结团率和碎片率上的效果相对有限，因此，开发一种能兼顾工艺简便和单细胞质量高的胰腺单细胞悬液的制备方法是非常有意义的。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种胰腺单细胞悬液的制备方法及其应用，具体提供一种结团率低、细胞活率高、满足单细胞转录组测序的胰腺单细胞悬液的制备方法及其应用。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种胰腺单细胞悬液的制备方法，所述胰腺单细胞悬液的制备方法包括如下步骤：
4、(1)将清洗并剪碎的胰腺组织块用由胶原酶ⅳ和脱氧核糖核酸酶i组成的混合酶进行消化处理，静置，分离上清液和组织块沉淀；
5、(2)将分离得到的上清液离心，取细胞沉淀进行消化终止处理，并细胞筛过滤；
6、(3)滤液再次离心，取细胞沉淀进行重悬，得到所述胰腺单细胞悬液。
7、本专利技术创造性地以胶原酶ⅳ和脱氧核糖核酸酶i的组合作为消化酶液，同时处理消化清洗并剪碎的胰腺组织块，相较于其他消化酶组合方式和其他消化处理方式，其在提高胰腺单细胞悬液中细胞活率和有核率、降低结团率和碎片率方面具有更优异的效果，进而使单细胞转录组测序的效果也更优异。
8、在本专利技术中，胰腺样本在进行清洗和剪碎处理前可以先保存于单细胞测序组织保存液中，置于1-6℃下保存。
9、优选地，所述胶原酶ⅳ在消化体系中的浓度为1-2mg/ml，例如1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml等；脱氧核糖核酸酶i在消化体系中的浓度为0.01-0.05mg/ml，例如0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
10、当胶原酶ⅳ和脱氧核糖核酸酶i在消化体系中的浓度满足上述特定的数值范围时，其配合效果更优，相较于其他浓度选择方式，其在提高胰腺单细胞悬液中细胞活率和有核率、降低结团率和碎片率方面具有更优异的效果，进而使单细胞转录组测序的效果也更优异。
11、所述混合酶示例性地可以由如下方式配制得到：
12、将胶原酶ⅳ加入hbss培养基中进行溶解，得到母液；将含bsa的dmem培养基加入到母液中，将胶原酶ⅳ进行稀释；将脱氧核糖核酸酶i加入稀释后的溶液中，得到胶原酶ⅳ和脱氧核糖核酸酶i的浓度满足要求的混合酶。
13、优选地，所述消化处理在35-40℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)下进行10-18min(例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min等)。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14、优选地，所述消化处理的同时还进行搅拌，搅拌的速度为100-250rpm，例如100rpm、120rpm、130rpm、150rpm、170rpm、180rpm、200rpm、250rpm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
15、优选地，所述静置的时间为40-110s，例如40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
16、在本专利技术制备方法中，消化时间和静置时间都不宜过长，以避免胰腺中的消化酶破坏胰腺细胞，消化时间优选10-18min、静置时间优选40-110s，能较好地兼顾最终单细胞悬液中的细胞活率指标和结团率指标。
17、优选地，步骤(1)所述进行消化处理，静置，分离上清液和组织块沉淀的操作共循环重复3-4次，取最后一次获得的上清液。即每次消化处理并静置后取组织块沉淀再次进行消化处理并静置，往复进行3-4次，取最后一次获得的上清液。
18、在本专利技术制备方法中，消化和静置处理优选进行3次或4次，前两次或三次获得的上清液由于会出现胰腺细胞破损、细胞活性差的情况，均舍弃，本专利技术创造性地发现相较于消化和静置处理进行2次以内或5次以上，进行3次或4次后获得的上清液在提高细胞活率和有核率、降低结团率和碎片率方面的效果更好。
19、优选地，步骤(2)和步骤(3)所述离心各自独立地在2-8℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等)下以300-800g(例如300g、400g、500g、600g、700g、800g等)进行3-8min(例如3min、4min、5min、6min、7min、8min等)。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
20、优选地，所述消化终止处理采用含0.01-2％ bsa的培养基；其中bsa的浓度可以选择为0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述胰腺单细胞悬液的制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述胶原酶Ⅳ在消化体系中的浓度为1-2mg/mL，脱氧核糖核酸酶I在消化体系中的浓度为0.01-0.05mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述消化处理在35-40℃下进行10-18min；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述进行消化处理，静置，分离上清液和组织块沉淀的操作共循环重复3-4次，取最后一次获得的上清液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述离心各自独立地在2-8℃下以300-800g进行3-8min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述消化终止处理采用含0.01-2％BSA的培养基；
7.根据权利要求1-6中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法
8.根据权利要求1-7中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述剪碎在胰腺样本浸润于含0.01-2％BSA的培养基下进行；
9.根据权利要求1-8中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞沉淀重悬于含0.01-2％BSA的培养基中；
10.根据权利要求1-9中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法在单细胞转录组测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述胰腺单细胞悬液的制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述胶原酶ⅳ在消化体系中的浓度为1-2mg/ml，脱氧核糖核酸酶i在消化体系中的浓度为0.01-0.05mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述消化处理在35-40℃下进行10-18min；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述进行消化处理，静置，分离上清液和组织块沉淀的操作共循环重复3-4次，取最后一次获得的上清液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的胰腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述离心各自独立地在2-8℃下以...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙照辉，徐英，任建洪，
申请(专利权)人：苏州帕诺米克生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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