一种N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸中有关物质的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种N

【技术实现步骤摘要】
一种N
‑
芴甲氧羰基
‑
L
‑
苯丙氨酸中有关物质的检测方法


[0001]本专利技术属于医药检测
，涉及一种N
‑
芴甲氧羰基
‑
L
‑
苯丙氨酸中有关物质的检测方法。

技术介绍

[0002]目前已上市的多肽药物大部分可通过化学合成法进行制备，多肽药物主要由氨基酸或者氨基酸衍生物组成，可以通过氨基酸逐步连接或者多个肽链片段缩合，再经过后续的裂解，纯化等得到最终产品。而化学合成法中主流为固相合成法，其中Fmoc法采用碱可脱除的Fmoc为α
‑
氨基保护基，侧链保护采用三氟醋酸可脱除的叔丁氧羰基等。合成中所采用的Fmoc
‑
保护氨基酸的有关物质情况直接影响了产品的最终的质量和收率。若有一套能够准确度高的检测方法，可以防止保护氨基酸中超限的杂质带入产品中，为后续的纯化工序减轻难度，同时提高了收率，最终降低了生产成本。
[0003]N
‑
芴甲氧羰基
‑
L
‑
苯丙氨酸，简称Fmoc
‑
Phe
‑
OH，属于Fmoc
‑
保护氨基酸，在多肽的固相合成中，使用频率较高的一个产品。从保护氨基酸的工艺过程可以看出，N
‑9‑
芴甲氧基羰基氧琥珀酰亚胺(Fmoc
‑
Osu)为制备Fmoc
‑
保护氨基酸的起始物料，会带入未反应完全的Fmoc
‑
Osu，以及还有其他的副反应杂质等。在制备Fmoc
‑
Phe
‑
OH时，根据推导，可能产生以下杂质：1、工艺过程中残留杂质：Fmoc
‑
Osu(9
‑
芴甲基
‑
N
‑
琥珀酰亚胺碳酸酯)；2、工艺过程中副反应杂质：Fmoc
‑
OH(9
‑
芴甲醇)、HOSU(N
‑
羟基丁二酰亚胺)、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
OH(N
‑
芴甲氧羰基
‑
β
‑
丙氨酸)、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
Phe
‑
OH(N
‑
芴甲氧羰基
‑
β
‑
丙氨酸
‑
苯丙氨酸)、Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
‑
OH(N
‑
芴甲氧羰基
‑
苯丙氨酰
‑
苯丙氨酸)。这些杂质的存在会严重的影响Fmoc
‑
Phe
‑
OH的质量，从而影响固相合成的终产品，难以达到质控标准，生产成本增加。故如果开发出能有效检出各潜在杂质的分析方法，对保护氨基酸的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
[0004]现有的技术方案或以甲醇作为流动相，或流动相中含有三乙胺、磷酸或者缓冲盐。甲醇在低波长下有紫外吸收，若以甲醇为流动相，会降低分析方法的灵敏度，而且系统压力高。流动相中含三乙胺，会对色谱柱造成不可逆损伤，使色谱柱使用寿命缩短；在梯度运行时，流动相中含磷酸会导致基线严重漂移；流动相中缓冲盐的存在会使系统基线不稳，空白试验中存在较多干扰峰，使方法的灵敏度降低，而且缓冲盐容易析出，会造成系统管路堵塞。另外，现有的技术方案检测存在液相纯度与滴定法测含量的结果相差甚远的情况，导致这种情况出现的原因之一可能就是该方法在检测过程中，对主峰与杂质分离不完全，主峰中包含杂质峰，以至于结果中纯度高，这样的有关物质分析方法是存在缺陷的，所得的结果也不准确，对生产、研发和提纯没有实质性的指导作用。
[0005]为了能开发出有效检出各潜在杂质的分析方法，技术人员多年来一直在进行研究实验，但始终没有明显进展，作为近年来具有一定技术突破的分析技术，技术人员开发了一种以乙腈、超纯水、三氟乙酸作为流动相的保护氨基酸检验方法，但是该检验方法在实际应用时，为了保证检测结果的准确性，流动相(三氟乙酸)的浓度要达到2％以上，流动相浓度
过大，使流动相酸性过大，样品在该流动相中会发生部分分解，并产生其它杂质，其不仅会导致检测结果不准确，而且流动相腐蚀性强，对仪器伤害大，而如果低于这个浓度，杂质分离效果较差，检测准确性又会下降，因此，该检验方法的准确性和实用性不高。

技术实现思路

[0006]在多肽合成中，为了更好的控制产品质量，须对杂质进行准确的分析，为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种N
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芴甲氧羰基
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L
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苯丙氨酸中有关物质的检测方法，所述有关物质为HOSU、Fmoc
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OH、Fmoc
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Osu、Fmoc
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β
‑
Ala
‑
OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
Phe
‑
OH、Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
‑
OH；
[0008]进一步的，所述检测方法包括：
[0009](1)色谱条件：
[0010]a.色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0011]b.流动相：流动相A为纯化水，并且添加85％v/v磷酸调节pH至2.1～2.5；
[0012]流动相B为乙腈；
[0013]c.洗脱程序：所述洗脱时间为50min，采用如表1所示的梯度洗脱程序：
[0014]表1
[0015]时间/min流动相A％，v/v流动相B％，v/v07525502080
[0016]d.检测器：检测器为光电二极管阵列(即DAD)检测器；
[0017]e.柱温：30℃～40℃；
[0018](2)混合标准品溶液和供试品溶液：
[0019]a.配制标准品溶液：分别精密称取HOSU、Fmoc
‑
OH、Fmoc
‑
Osu、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
Phe
‑
OH、Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
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OH、Fmoc
‑
Phe
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OH对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中分别含0.001mg HOSU、Fmoc
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
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芴甲氧羰基
‑
L
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苯丙氨酸中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质为HOSU、Fmoc
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OH、Fmoc
‑
Osu、Fmoc
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β
‑
Ala
‑
OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
Phe
‑
OH以及Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
‑
OH。2.根据权利要求1所述的N
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芴甲氧羰基
‑
L
‑
苯丙氨酸中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：(1)色谱条件：a.色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；b.流动相：流动相A为纯化水，并且添加85％v/v磷酸调节pH至2.1～2.5；流动相B为乙腈；c.洗脱程序：所述洗脱时间为50min，采用如表1所示的梯度洗脱程序：表1时间/min流动相A％，v/v流动相B％，v/v07525502080d.检测器：检测器为光电二极管阵列(即DAD)检测器；e.柱温：30℃～40℃；(2)混合标准品溶液和供试品溶液：a.配制标准品溶液：分别精密称取HOSU、Fmoc
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OH、Fmoc
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Osu、Fmoc
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β
‑
Ala
‑
OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
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Phe
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OH、Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
‑
OH、Fmoc
‑
Phe
‑
OH对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中分别含0.001mg HOSU、Fmoc
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OH、Fmoc
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Osu、Fmoc
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β
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Ala
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OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
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Phe
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OH、Fmoc
‑
Phe
‑
Phe
‑
OH以及含0.5mg Fmoc
‑
Phe
‑
OH的混合标准品溶液；b.配制供试品溶液：精密称取适量供试品，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中分别含0.5mg/mL的供试品溶液；(3)测定法：取稀释剂、混合标准品溶液以及供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐群莲，肖家海，梁奉岗，米彬彬，
申请(专利权)人：重庆莱美隆宇药业有限公司，
类型：发明
国别省市：