诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和细胞治疗领域，公开了诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用；包括步骤：在第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养胆囊源干细胞，从而获得功能性肝实质细胞。本发明专利技术获得的功能性肝实质细胞具有较高的分化效率，具有治疗肝脏相关疾病的作用。具有治疗肝脏相关疾病的作用。具有治疗肝脏相关疾病的作用。

【技术实现步骤摘要】
诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用


[0001]本专利技术涉及功能性肝实质细胞领域，具体为诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用。

技术介绍

[0002]我国是肝脏疾病高发国家，由病毒、药物、食物、遗传等引起的急慢性肝病会导致肝脏发生功能性衰竭，其中慢性损伤更是肝炎、肝硬化和肝癌的重要诱因，及时干预和救治将会有效避免病人死亡(Changing global epidemiology of liver cancer from 2010to 2019:NASH is the fastest growing cause of liver cancer；PMID:33734139)。细胞替代疗法为治疗肝脏疾病提供了候选方案，通过移植具有功能的肝细胞有望解决临床上治疗肝病的一些问题，如肝脏器官供体短缺、药物引起的肝功能不全和副作用伤害等。更重要的是，有研究报道，肝细胞移植对罕见病如肝豆状核变性、1型酪氨酸血症等染色体遗传代谢病，有着显著的治疗效果，可帮助病人度过危险时期等候进一步治疗。
[0003]获取具有功能的肝细胞可为肝脏疾病的细胞疗法提供细胞来源。目前常用方法包括：肝脏原位分离、诱导胚胎干细胞定向分化、体细胞重编程以及其他来源细胞诱导分化等。不同方式获取的肝样细胞各有千秋：1)由肝脏组织通过消化、分离、富集是经典的体外获取功能性肝细胞的方法，优势是肝细胞功能齐全，移植后一般具有显著治疗效果；但是其来源有限、不可大量扩增，因此难以广泛使用。2)胚胎干细胞来源充足，可定向诱导分化获得肝细胞样细胞，具有部分肝细胞功能；缺点是分化效率有限，残留的干细胞具有致瘤性，且一直备受伦理争议。3)重编程来的肝细胞样细胞，来源广泛，是目前研究的热点，提高诱导效率和增强功能是需要攻克的技术瓶颈。3)其他如间充质干细胞、造血干细胞等，也被报道具有分化为肝样细胞的能力。
[0004]胆囊组织是肝脏胆管系统的重要组成部分，胆囊和肝脏发育同源，组织来源广泛，理论上如果由胆囊来源的细胞分化为肝细胞样细胞具有一定可行性，且可以很好的解决细胞来源问题，更重要的是成体组织细胞一般不具有致瘤特征。前体研究表明可由胆囊中分离出具有干性特征的细胞，且具有一定分化能力。因此，建立胆囊源干细胞P生产体系、定向诱导分化，可提供新的功能肝细胞来源，有望为临床肝病的细胞治疗提供具有应用价值和竞争力的候选细胞来源。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法与应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，包括以下步骤：
[0008]S1：将胆囊组织预处理后加入消解液中孕育，过滤，离心收集细胞沉淀；在第一种培养体系下，在培养体系中培养细胞沉淀，得到胆囊源干细胞；
[0009]S2：将胆囊源干细胞扩增，消化，定向分化，得到分化细胞；在第二种培养体系下，在培养体系中培养分化细胞，得到肝细胞前体细胞；
[0010]S3：在第三种培养体系下，在培养体系中培养肝细胞前体细胞，得到功能性肝实质细胞。
[0011]进一步的，所述步骤S1中，培养体系为第一培养基；第一培养基包括如下组分：液体基础培养基、1
×
B27添加剂、1
×
N2添加剂、1
×
青链霉素、0.1
‑
50mM N
‑
乙酰半胱氨酸、0.1
‑
100ng/mL R
‑
spondin、1
‑
1000mM尼克酰胺、0.1
‑
100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1
‑
100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1
‑
100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1
‑
100μM ALK5抑制剂、0.1
‑
100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1
‑
100μM PKC抑制剂、0.1
‑
100μMATPase抑制剂、0.1
‑
100μM Rock抑制剂；
[0012]其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。
[0013]进一步的，所述步骤S2中，培养体系为第二培养基；第二培养基包括如下组分：液体基础培养基、1
×
B27添加剂、1
×
N2添加剂、1
×
青链霉素、0.1
‑
50mM N
‑
乙酰半胱氨酸、0.1
‑
100ng/mL R
‑
spondin、1
‑
1000mM尼克酰胺、0.1
‑
100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1
‑
100μM TGFβ抑制剂、0.1
‑
100μMγ
‑
Secretase抑制剂、0.1
‑
100μM EGFR抑制剂、0.1
‑
100μM Rock抑制剂；
[0014]其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。
[0015]进一步的，所述步骤S3中，培养体系为第三培养基；第三培养基包括如下组分：液体基础培养基、1
×
B27添加剂、1
×
N2添加剂、1
×
青链霉素、0.1
‑
50mM N
‑
乙酰半胱氨酸、0.1
‑
100ng/mL R
‑
spondin、1
‑
1000mM尼克酰胺、0.1
‑
100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1
‑
100ng/mL重组抑瘤素M、0.1
‑
100μMγ
‑
Secretase抑制剂、0.1
‑
100μMALK5抑制剂、0.1
‑
100μM地塞米松；
[0016]其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。
[0017]进一步的，所述胆囊源干细胞为胆囊炎切除胆囊组织和肝移植手术丢弃胆囊组织中任意一种。
[0018]进一步的，所述步骤S1中，在第一种培养条体系下，培养胆囊源干细胞培养时间为1
‑
15天；优选的，培养时间为10
‑
12天；
[0019]所述步骤S2中，在第二种培养体系下，培养胆囊源干细胞培养时间为10
‑
30天；优选的，培养时间为15
‑
20天；
[0020]所述步骤S3中，在第三种培养体系下，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：将胆囊组织预处理后加入消解液中孕育，过滤，离心收集细胞沉淀；在第一培养体系中培养细胞沉淀，得到胆囊源干细胞；S2：将胆囊源干细胞扩增，消化，定向分化，得到分化细胞；在第二培养体系中培养分化细胞，得到肝细胞前体细胞；S3：在第三培养体系中培养肝细胞前体细胞，得到功能性肝实质细胞。2.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，所述第一培养体系为第一培养基；第一培养基包括如下组分：液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、青链霉素、0.1
‑
50mM N
‑
乙酰半胱氨酸、0.1
‑
100ng/mL R
‑
spondin、1
‑
1000mM尼克酰胺、0.1
‑
100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1
‑
100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1
‑
100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1
‑
100μM ALK5抑制剂、0.1
‑
100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1
‑
100μM PKC抑制剂、0.1
‑
100μM ATPase抑制剂、0.1
‑
100μM Rock抑制剂；其中，液体基础培养基：B27添加剂：N2添加剂：青链霉素的体积比为1：1：1：1。3.根据权利要求1所述的一种诱导胆囊源干细胞分化为功能性肝实质细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，所述第二培养体系为第二培养基；第二培养基包括如下组分：液体基础培养基、B27添加剂、N2添加剂、青链霉素、0.1
‑
50mM N
‑
乙酰半胱氨酸、0.1
‑
100ng/mL R
‑
spondin、1
‑
1000mM尼克酰胺、0.1
‑
100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1
‑
100μM TGFβ抑制剂、0.1
‑
100μMγ
‑
Secretase抑制剂、0.1

【专利技术属性】
技术研发人员：陈费，王敏君，金宜强，徐守佳，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：