产生肝细胞的方法技术

本发明专利技术涉及通过过表达转录因子组合产生肝细胞的方法，特别是用于细胞重新编程的方法中。中。中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生肝细胞的方法


[0001]本专利技术涉及通过过表达转录因子的组合来产生肝细胞的方法。

技术介绍

[0002]肝细胞是肝脏的主要功能细胞。它们提供广泛的基本功能，包括调节葡萄糖和脂质代谢、各种代谢物和药物的解毒、蛋白质合成和胆汁合成。
[0003]在药物筛选中，必须确定潜在的候选药物是否会引起肝毒性。目前，肝毒性和药物剂量的筛选通常使用一系列永生化肝细胞系和人原代肝细胞。然而，永生化细胞不具备关键的肝脏药物代谢功能。原代肝细胞提供有限、具有分离和冷冻保存压力、并显示出批次间的差异，因此不适用于高通量筛选。此外，人原代肝细胞的药物代谢功能会因遗传背景而显著变化。可获得的功能性人肝细胞的一致的且具有规模的提供将极大地促进药物开发和肝衰竭治疗的临床应用。先前已经研究了从诱导的多能干细胞(iPSC)生成肝细胞，但是当前的现有技术方法不能提供高通量药物筛选所需的功能性、一致性和规模性水平。此外，用当前方法制备的源自iPSC的肝细胞仍然存在代谢缺陷，因此不适合作为预测性的生理模型(Williams，2018年)。
[0004]源自iPSC的肝细胞可以通过多种方式促进药物发现和细胞治疗。成熟的肝细胞可作为原代肝细胞的替代物用于药物发现，以测试药物对肝脏的影响(Williams，2018)。源自iPSC的肝细胞的另一个益处是它们能够模拟肝脏疾病。因此，它们提供了独特的工具来测试药物对来自患者的细胞的功效。对于患有急性肝衰竭或肝源性代谢疾病的患者，与基因治疗相结合时，未成熟或成熟肝细胞或肝祖细胞的移植可以替代全肝移植(Iansante等人.，2018)。
[0005]因此，本领域需要提供产生适合用作研究工具和潜在治疗剂的肝细胞的方法。

技术实现思路

[0006]根据本专利技术的第一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，和培养该细胞群以获得肝细胞。
[0007]根据本专利技术的另一方面，提供了一种从源细胞生产肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]a)将编码转录调节蛋白的基因靶向插入源细胞的第一遗传安全港位点；和
[0009]b)靶向插入至少三种或更多种转录因子至源细胞的第二遗传安全港位点，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；
NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，所述基因可操作地连接诱导型启动子，其中所述诱导型启动子受转录调节蛋白调节；和；
[0010]c)培养包含插入物的源细胞以获得肝细胞。
[0011]根据本专利技术的另一方面，提供了至少三种或更多种转录因子用于生成肝细胞的用途，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。
[0012]根据本专利技术的另一方面，提供了可通过本文定义的任何一种方法获得的细胞。
[0013]根据本专利技术的另一方面，提供了一种细胞，其包含一个或多个外源表达盒，所述外源表达盒编码至少三种或更多种转录因子，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。
[0014]根据本专利技术的另一方面，提供了如本文所定义的用于治疗的细胞。
[0015]根据本专利技术的另一方面，提供了一种用于将细胞分化为肝细胞的试剂盒，其包含：
[0016](i)源细胞和激活或增加至少三种或更多种转录因子的表达或量的试剂；和/或
[0017](ii)一个或多个表达盒，其编码至少三种或更多种转录因子，
[0018]其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。
[0019]根据本专利技术的另一方面，提供了本文定义的试剂盒用于将细胞分化成肝细胞的用途。
[0020]根据本专利技术的另一方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括使使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞与药物接触，以及观察由药物诱导的肝细胞的变化。
[0021]根据本专利技术的另一方面，提供了一种治疗患有肝脏疾病或功能障碍或处于肝脏疾病或功能障碍风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞。
附图说明
[0022]图1.具有肝脏重新编程活性的TF的筛选策略
[0023]用一组慢病毒载体转导携带与红色荧光蛋白融合的白蛋白基因(ALB:RFP)和与绿色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，和培养该细胞群以获得肝细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3，(2)NR1I2或NR1I3，和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、ARID3C、CUX2、HNF4A、HNF4G、NR0B2、ONECUT1、ONECUT2、RXRA、SALL1、SREBF1及其变体。3.如权利要求2所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3；(2)NR1I2或NR1I3；和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、HNF4A、HNF4G、ONECUT1、RXRA、SREBF1；及其变体。4.如权利要求3所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3；(2)NR1I2或NR1I3；和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、HNF4A、RXRA、SREBF1；及其变体。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述三种转录因子包括FOXA1、CREB3L3、NR1I2或其变体。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述三种转录因子包括FOXA1、HHEX、NR1I2或其变体。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加FOXA1、CREB3L3、NR1I2、HHEX或其变体的表达。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加至少四种或更多种转录因子，特别是五种、六种或七种或更多种转录因子的表达。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加三种至七种转录因子的表达。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述非肝细胞群包括源细胞。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述非肝细胞群包括多能干细胞，特别是诱导型多能干细胞。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过多能干细胞或诱导型多能干细胞的细胞重新编程来产生肝细胞。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述肝细胞为人肝细胞。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述细胞群的至少一种肝细胞的特征。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述特征选自以下一种或多种：(i)表达一种或多种肝细胞标志物，例如葡萄糖
‑6‑
磷酸酶、白蛋白、α1
‑
抗胰蛋白酶(AAT)、延胡索乙酰乙酸酶(FAH)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、乙醇脱氢酶1、精氨酸酶I型、细胞色素p450 3A4(CYP3A4)、细胞色素p450 2C9(CYP2C9)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶1家族、多肽A1(UGT1A1)、肝脏特异性有机阴离子转
运蛋白(LST
‑
1)或组合；(ii)葡萄糖
‑6‑
磷酸酶、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白合成和分泌、胆汁产生或分泌、尿素产生或异型生物质解毒的活性；或者(iii)肝细胞形态特征。16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述特征包括选自白蛋白和CYP3A4的肝细胞标志物。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，通过使所述细胞群与所述转录因子或激活或增加所述转录因子的表达或量的一种或多种试剂接触来增加所述转录因子的表达。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述转录因子的表达是受控的转录。19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中使用包括以下的方法将编码一种或多种转录因子的序列引入细胞群：
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：倍特博有限公司，
类型：发明
国别省市：