一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒，所述亲和磁珠由MARCKS

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒


[0001]本专利技术属于临床检验领域，特别涉及一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(EVs)是指细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡的统称，根据大小、生物特性和形成过程的不同，EVs主要分为外泌体(exosomes)、微囊泡(microvesicles，MV)和凋亡小体(apoptotic bodies)三大类。外泌体是由多囊泡体与细胞膜融合形成的直径30～150nm的EVs，广泛存在于血液、唾液、尿液及母乳等体液中，携带表征母体细胞性质的核酸、蛋白、代谢物、磷脂等多重生物标志物，具有磷脂双分子层保护，内含物稳定，是细胞间基础生理通讯机制。外泌体在多种癌症的发生与演进中发挥重要作用，其可促进多种癌症微环境形成，增强肿瘤侵袭与转移能力，参与肿瘤免疫抑制及肿瘤靶向耐药抵抗，且对多种癌症的早期诊断和治疗具有应用价值。
[0003]目前，外泌体的提取纯化常用的方法有差速超速离心法、切向流超滤法、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法、免疫捕获法、微流控芯片分离法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是需要配备超速离心机，操作费时费力、高度依赖人工、难以应用到临床检测中。而且，血浆或血清中存在大量高密度脂蛋白，其密度分布与外泌体重叠，而超速离心法是基于密度和粒径进行分离的，难以实现外泌体与高密度脂蛋白的完全分离。切向流超滤法虽然可以方便快速的提取外泌体，但不能区分大小与外泌体相近的乳糜颗粒或脂蛋白。排阻色谱法也存在同样的问题，且对样本造成稀释，通常需要联合其他方法对所得样品进行浓缩。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，只能特异性富集某种表面蛋白阳性的外泌体。微流控芯片分离法对材料及技术的要求高，使用成本通常较高，且难以处理体积较大的样品。
[0004]富士和光公司开发的MagCapture外泌体提取试剂盒PS提供了一种新型的亲和策略(即PS亲和法)，通过采用磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白TIM4和磁珠，可以分离出膜表面具有PS的高纯度外泌体和其他细胞外囊泡。该试剂盒采取金属离子依赖方式捕获外泌体，通过使用螯合剂，可在中性条件下洗脱出完整外泌体。但是，该试剂盒只能处理血清和肝素抗凝血浆样本，对于EDTA和枸橼酸钠等金属螯合剂抗凝的血浆样本，需要经过添加肝素的方式处理样本，步骤繁琐。并且整个操作过程从样本前处理到亲和反应再到洗脱得到纯化的外泌体大约需要5小时，在临床检验上基本不可接受。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种外泌体提取亲和磁珠及其提取试剂盒，亲和磁珠的优势在于磁珠比表面积大，多肽的空间位阻小，磁珠载量高，所形成的试剂盒提取方案便于开展临床应用，助力液体活检事业发展。
[0006]本专利技术提供了一种外泌体提取亲和磁珠，由MARCKS
‑
ED多肽固化于磁珠表层，并修
饰羧基、氨基或链霉亲和素SA而得。
[0007]所述MARCKS
‑
ED多肽序列如下1)
‑
6)任一项所述：
[0008]1)KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK(SEQ ID NO:1)；
[0009]2)KKSFKLSGFSFKKNKK(SEQ ID NO:2)；
[0010]3)KRFSFKK(SEQ ID NO:3)；
[0011]4)KKRFSFKK(SEQ ID NO:4)；
[0012]5)KKRFSFKKF(SEQ ID NO:5)；
[0013]6)KKFSFKKF(SEQ ID NO:6)；
[0014]所述MARCKS
‑
ED多肽序列中的氨基酸为D
‑
型氨基酸。
[0015]所述磁珠为Fe3O4内核的硅基磁珠，表面修饰羧基、氨基或链霉亲和素SA，直径范围200nm
‑
3000nm。
[0016]本专利技术还提供了一种外泌体提取亲和磁珠的制备方法，包括如下步骤：
[0017]对羧基磁珠进行预处理，再经EDC活化后与MARCKS
‑
ED多肽偶联，最后封闭、保存，得到外泌体提取亲和磁珠。其中，所述MARCKS
‑
ED多肽的N端具有修饰FITC荧光素或其他修饰，如5
‑
FAM修饰、NBD修饰、Dansyl修饰、HYNIC修饰、DTPA修饰、MCA修饰等。
[0018]具体方法如下：
[0019]1)磁珠预处理：混匀磁珠后，取100μL Mag
‑
COOH磁珠到1.5mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200μL MEST溶液(0.1MMES，pH 6.0，0.05％Tween 20)进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；
[0020]2)EDC活化：迅速加入新鲜配制的100μL EDC溶液(10mg/mL，以上述MEST溶液作分散剂)和100μL NHS(10mg/mL，以上述MEST溶液作分散剂)溶液到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化60min，该期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；经过上述步骤之后，磁珠表面的羧基已经活化，可以与带有伯氨基的生物配体进行共价偶联；
[0021]3)磁珠偶联：磁性分离去除上清液，加入200μg～800μg MARCKS
‑
ED多肽(合适用量及浓度需要根据具体实验进行优化，保持溶液pH≈8.0，可加入0.05％Tween 20以提高磁珠分散性，避免缓冲体系中存在除生物配体以外含有伯氨基的试剂)，轻柔地混匀，25℃偶联2h，或25℃偶联1h后放置4℃静置过夜，偶联期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；
[0022]4)封闭：将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，加入200
‑
500μL Tris
‑
HCl(0.1M，pH＝8.0)重悬磁珠，25℃反应3h封闭磁珠表面非特异性吸附位点，封闭后，再加入200
‑
500μL BSA/PBS溶液(pH7.2，含1％BSA)二次封闭1h，该期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；
[0023]5)保存：离心管置于磁性分离器上磁性分离去除上清液，每次用200μL PBS溶液(pH 7.2)或保存溶液洗涤3次后，重新悬浮于保存溶液中(可根据需要来确定保存溶液的加入量，以调整偶联配体磁珠的浓度)，保存于4℃。可以在保存溶液中加入0.02％(w/v)叠氮化钠(NaN3)作为抑菌剂。
[0024]结合上述步骤完成，磁珠可用于后续操作。
[0025]本专利技术还提供了一种外泌体提取亲和磁珠的制备方法，包括如下步骤：
[0026]对氨基磁珠进行预处理，再与经EDC活化后的MA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体提取亲和磁珠，其特征在于：由MARCKS
‑
ED多肽固化于磁珠表层，并修饰羧基、氨基或链霉亲和素SA而得。2.根据权利要求1所述的外泌体提取亲和磁珠，其特征在于：所述MARCKS
‑
ED多肽序列如下1)
‑
6)任一项所述：1)KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK(SEQ ID NO:1)；2)KKSFKLSGFSFKKNKK(SEQ ID NO:2)；3)KRFSFKK(SEQ ID NO:3)；4)KKRFSFKK(SEQ ID NO:4)；5)KKRFSFKKF(SEQ ID NO:5)；6)KKFSFKKF(SEQ ID NO:6)；所述MARCKS
‑
ED多肽序列中的氨基酸为D
‑
型氨基酸。3.根据权利要求1所述的外泌体提取亲和磁珠，其特征在于：所述磁珠为Fe3O4内核的硅基磁珠。4.一种外泌体提取亲和磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对羧基磁珠进行预处理，再经EDC活化后与MARCKS
‑
ED多肽偶联，最后封闭、保存，得到外泌体提取亲和磁珠；或者对氨基磁珠进行预处理，再与经EDC活化后的MARCKS
‑
ED多肽偶联，最后封闭、...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹航，李振韬，于海伦，
申请(专利权)人：亿航苏州生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：