一种测定组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和五味子醇甲浓度的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和/或五味子醇甲浓度的方法，该方法包括以下步骤：(1)待测组织样本预处理，获取待测液；(2)马索亚内酯和/或五味子醇甲标准曲线制备；以及(3)液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种测定组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和五味子醇甲浓度的方法


[0001]本专利技术涉及生物样品色谱检测
，尤其涉及一种采用UHPLC
‑
MS/MS法测定哺乳动物组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和五味子醇甲的测定方法。

技术介绍

[0002]慢性肝病病程长，病情复杂，但从中医上来说主要是机体感染疫毒，引起正邪相搏，如正气虚则不能祛邪，至病情缠绵久致顽疾，其基本病机为正虚邪实、虚实共存。正虚主要是气阴两虚，而邪实则为蕴热化湿，血瘀络阻，气阴两虚、湿热疫毒内留。从西医角度来说肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特征，肝纤维化与肝硬化既有联系又有区别，从病理上看，仅有弥漫性肝纤维沉积增加称肝纤维化，而弥漫性肝纤维化同时伴有肝小叶结构被破坏则为肝硬化。从发病学看，肝纤维化是肝硬化的前期病变、是可逆的、而肝硬化是肝纤维化进一步发展的结果。从临床观察看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，肝纤维化一般不致肝功能障碍，但可有门静脉高压。肝纤维化是肝损伤后的修复过程，引起肝脏细胞外基质(ECM)和量的改变。
[0003]肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化所必经的病理过程，寻找阻止、延缓甚至逆转肝纤维化的药物，是肝病研究急待解决的问题。长期以来，中医药在抗肝纤维化方面发挥着重要的作用。中医认为，肝纤维化既有瘀滞的一面，也有正气虚损的一面，扶正化瘀是重要的治疗原则。扶正化瘀胶囊(片剂)正是针对慢性肝炎肝纤维化、肝硬化的“瘀血内结、正气虚弱”，在反复药理研究基础上而配伍组方研制的，由活血化瘀和益精补虚类药物组成。其中丹参活血化瘀，为君药；虫草菌丝补虚益精，桃仁去瘀破癓，为臣药；松花粉养肝散肝，绞股蓝清热解毒，为佐药；五味子酸温补肝，为使药。药理实验表明，该复方制剂具有抗肝纤维化，降低门脉压力，保护肝细胞，减轻脂质过氧化损伤，调整免疫功能，减轻肝脏炎症等功效。扶正化瘀制剂经临床验证可使肝纤维化分期运转率达52％～58.3％，因此，扶正化瘀制剂治疗肝硬化失代偿疗效明显。
[0004]扶正化瘀制剂是由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子六味药组成，具有治疗肝、肺、肾纤维化的作用。目前上市有两种剂型：(1)扶正化瘀胶囊：2002年获得中国国家新药证书(国药证字Z20020053)，并批准国家药品标准WS3
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459(Z
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79)
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2005(Z)；(2)扶正化瘀片剂：2005年获得国家新药证书(国药证字Z20050564)，并批准国家药品标准YBZ19332005
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2009Z。扶正化瘀制剂主要用于乙型肝炎肝纤维化属瘀血阻络，肝肾不足证者，症见胁下痞块，胁肋疼痛，面色晦暗，或见赤缕红斑，腰膝酸软，疲倦乏力，头晕目涩，舌质暗红或有瘀斑，苔薄或微黄，脉弦细。
[0005]目前，扶正化瘀制剂有效成分入哺乳动物组织的研究尚处于空白阶段，国内外无相关研究报导，也缺乏该扶正化瘀制剂在哺乳动物组织中马索亚内酯、五味子醇甲的测定方法，扶正化瘀制剂在各大组织中的分布不清楚，难以为质量控制及指导临床合理用药提
供依据。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种测定组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和/或五味子醇甲浓度的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)待测组织样本预处理，获取待测液；
[0008](2)马索亚内酯和/或五味子醇甲标准曲线制备；以及
[0009](3)液相色谱
‑
质谱联用检测该待测液中马索亚内酯和/或五味子醇甲浓度，
[0010]其中，该液相色谱
‑
质谱联用的色谱条件为：色谱柱：Acquity BEHC
18
柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)，流动相：水相(A)为酸水溶液，有机相(B)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0
‑
1min，95％A；1
‑
6min，95％
‑
68％A；6
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12min，68％
‑
45％A；12
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15min，45％
‑
5％A；15
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19min，5％A；19.01min，95％A；19.01
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22min，95％A，
[0011]其中，该液相色谱
‑
质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，质量扫描范围m/z120
‑
500。
[0012]进一步地，该待测组织样本为哺乳动物的心、肝、脾或肾。
[0013]进一步地，该哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。
[0014]进一步地，该预处理包括以下步骤：
[0015](1)给予该扶正化瘀制剂后，分别于不同时间点将哺乳动物处死，分离该组织样本，放入生理盐水中漂洗以除去血液，滤纸拭干；
[0016](2)称取该组织样本，剪碎，置于离心管中，加入第一溶剂溶解，匀浆再离心，得到上清液；以及
[0017](3)将该上清液冷冻干燥，加入第二溶剂复溶，涡旋再离心，得到该待测液。
[0018]进一步地，该第一溶剂和该第二溶剂是相同的或不同的。
[0019]进一步地，该第一溶剂和该第二溶剂选自水、C1～C4的醇、二醇、乙腈中的一种或多种。
[0020]进一步地，该第一溶剂为乙腈。
[0021]进一步地，该第二溶剂为95％乙腈的水溶液。
[0022]进一步地，该不同时间点为15min、30min、120min和360min。
[0023]进一步地，该离心的条件为8,000～15,000rpm，4℃条件下离心8～15min。
[0024]进一步地，该组织样品的重量为600～1000mg。
[0025]进一步地，该第一溶剂的体积为300～1500μl。
[0026]进一步地，该上清液的体积为500～1000μl。
[0027]进一步地，该第二溶剂的体积为50～150μl。
[0028]进一步地，该匀浆的条件为65～80HZ，30s至2min，2～5次。
[0029]进一步地，该涡旋的时间为20s至2min。
[0030]进一步地，该待测液的体积为50～100μl。
[0031]进一步地，该离心的条件为10,000～12,000rpm，4℃条件下离心8～15min。
[0032]进一步地，该组织样品的重量为600mg。
[0033]进一步地，该第一溶剂的体积为1000μl。
[0034]进一步地，该上清液的体积为800μl。
[0035]进一步地，该第二溶剂的体积为100μl。
[0036]进一步地，该匀浆的条件为65HZ，50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定组织中扶正化瘀制剂马索亚内酯和/或五味子醇甲浓度的方法，所述方法包括以下步骤：(1)待测组织样本预处理，获取待测液；(2)马索亚内酯和/或五味子醇甲标准曲线制备；以及(3)液相色谱
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质谱联用检测所述待测液中马索亚内酯和/或五味子醇甲浓度，其中，所述液相色谱
‑
质谱联用的色谱条件为：色谱柱：AcquityBEH C
18
柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)，流动相：水相(A)为酸水溶液，有机相(B)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0
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1min，95％A；1
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6min，95％
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68％A；6
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12min，68％
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45％A；12
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15min，45％
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5％A；15
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19min，5％A；19.01min，95％A；19.01
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22min，95％A；其中，所述液相色谱
‑
质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，质量扫描范围m/z 120
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500。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测组织样本为哺乳动物的心、肝、脾或肾；优选地，所述哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括以下步骤：(1)给予所述扶正化瘀制剂后，分别于不同时间点将哺乳动物处死，分离所述组织样本，放入生理盐水中漂洗以除去血液，滤纸拭干；(2)称取所述组织样本，剪碎，置于离心管中，加入第一溶剂溶解，匀浆再离心，得到上清液；以及(3)将所述上清液冷冻干燥，加入第二溶剂复溶，涡旋再离心，得到所述待测液；优选地，所述第一溶剂和所述第二溶剂是相同的或不同的；更优选地，所述第一溶剂和所述第二溶剂选自水、C1～C4的醇、二醇、乙腈中的一种或多种；特别优选地，所述第一溶剂为乙腈，所述第二溶剂为95％乙腈的水溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述不同时间点为15min、30min、120min和360min；优选地，所述离心的条件为8,000～15,000rpm，4℃条件下离心8～15min；优选地，所述组织样品的重量为600～1000mg；优选地，所述第一溶剂的体积为300～1500μl；又优选地，所述上清液的体积为500～1000μl；更优选地，所述第二溶剂的体积为50～150μl；尤其优选地，所述匀浆的条件为65～80HZ，30s至2min，2～5次；特别优选地，所述涡旋的时间为20s至2min；又特别优选地，所述待测液的体积为50～100μl。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为10,000～12,000rpm，4℃条件下离心8～15min，所述组织样品的重量为600mg，所述第一溶剂的体积为1000μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，潘一峰，王玉琳，胡叶青，柳雨亭，
申请(专利权)人：上海黄海制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：