一种测定血浆中扶正化瘀制剂五种有效成分浓度的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定血液中扶正化瘀制剂有效成分浓度的方法，该方法包括以下步骤：(1)待测样本预处理，获取待测液；(2)有效成分标准曲线制备；以及(3)液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种测定血浆中扶正化瘀制剂五种有效成分浓度的方法


[0001]本专利技术涉及生物样品色谱检测
，尤其涉及一种采用UHPLC
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MS/MS法测定血液中扶正化瘀制剂五种有效成分浓度的方法。

技术介绍

[0002]慢性肝病病程长，病情复杂，但从中医上来说主要是机体感染疫毒，引起正邪相搏，如正气虚则不能祛邪，至病情缠绵久致顽疾，其基本病机为正虚邪实、虚实共存。正虚主要是气阴两虚，而邪实则为蕴热化湿，血瘀络阻，气阴两虚、湿热疫毒内留。从西医角度来说肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特征，肝纤维化与肝硬化既有联系又有区别，从病理上看，仅有弥漫性肝纤维沉积增加称肝纤维化，而弥漫性肝纤维化同时伴有肝小叶结构被破坏则为肝硬化。从发病学看，肝纤维化是肝硬化的前期病变、是可逆的、而肝硬化是肝纤维化进一步发展的结果。从临床观察看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，肝纤维化一般不致肝功能障碍，但可有门静脉高压。肝纤维化是肝损伤后的修复过程，引起肝脏细胞外基质(ECM)和量的改变。
[0003]肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化所必经的病理过程，寻找阻止、延缓甚至逆转肝纤维化的药物，是肝病研究急待解决的问题。长期以来，中医药在抗肝纤维化方面发挥着重要的作用。中医认为，肝纤维化既有瘀滞的一面，也有正气虚损的一面，扶正化瘀是重要的治疗原则。扶正化瘀胶囊(片剂)正是针对慢性肝炎肝纤维化、肝硬化的“瘀血内结、正气虚弱”，在反复药理研究基础上而配伍组方研制的，由活血化瘀和益精补虚类药物组成。其中丹参活血化瘀，为君药；虫草菌丝补虚益精，桃仁去瘀破癓，为臣药；松花粉养肝散肝，绞股蓝清热解毒，为佐药；五味子酸温补肝，为使药。药理实验表明，该复方制剂具有抗肝纤维化，降低门脉压力，保护肝细胞，减轻脂质过氧化损伤，调整免疫功能，减轻肝脏炎症等功效。扶正化瘀制剂经临床验证可使肝纤维化分期运转率达52％～58.3％，因此，扶正化瘀制剂治疗肝硬化失代偿疗效明显。
[0004]扶正化瘀制剂是由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子六味药组成，具有治疗肝、肺、肾纤维化的作用。目前上市有两种剂型：(1)扶正化瘀胶囊：2002年获得中国国家新药证书(国药证字Z20020053)，并批准国家药品标准WS3
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459(Z
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79)
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2005(Z)；(2)扶正化瘀片剂：2005年获得国家新药证书(国药证字Z20050564)，并批准国家药品标准YBZ19332005
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2009Z。扶正化瘀制剂主要用于乙型肝炎肝纤维化属瘀血阻络，肝肾不足证者，症见胁下痞块，胁肋疼痛，面色晦暗，或见赤缕红斑，腰膝酸软，疲倦乏力，头晕目涩，舌质暗红或有瘀斑，苔薄或微黄，脉弦细。
[0005]整个扶正化瘀复方药效物质基础主要包含脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类、多糖、甾醇、多种氨基酸、多种维生素、挥发油、木脂素等。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定动
物血浆中扶正化瘀制剂主要有效成分浓度的UHPLC
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MS/MS方法，其中该有效成分为以下中的一种或多种：五味子醇乙、五味子甲素、丹酚酸D、咖啡酸和染料木素。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种测定血液中扶正化瘀制剂有效成分浓度的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)待测样本预处理，获取待测液；
[0008](2)有效成分标准曲线制备；以及
[0009](3)液相色谱
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质谱联用检测该待测液中该有效成分浓度，
[0010]其中，该液相色谱
‑
质谱联用的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，流动相：水相(A)为酸水溶液，有机相(B)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0
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12min，5％B；12
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14min，95％B；14
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16min，5％B；
[0011]其中，该液相色谱
‑
质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正负离子模式检测，质量扫描范围m/z 100
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800；
[0012]其中，该有效成分为以下中的一种或多种：五味子醇乙、五味子甲素、丹酚酸D、咖啡酸和染料木素。
[0013]进一步地，该待测样本为哺乳动物的血浆。
[0014]进一步地，该哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。
[0015]进一步地，该预处理包括以下步骤：
[0016](1)吸取该待测样本，添加至第一96孔板中；
[0017](2)在该第一96孔板中添加内标工作液；
[0018](3)封板后涡旋混匀并离心，得到第一上清液；
[0019](4)吸取该第一上清液，添加至第二96孔板中；
[0020](5)在该第二96孔板中添加第一溶剂；以及
[0021](6)封板后涡旋混匀并离心，得到该待测液。
[0022]进一步地，该有效成分标准曲线制备包括以下步骤：
[0023](1)分别吸取校正标示样品和质控样品，分别添加至第一96孔板中；
[0024](2)在该第一96孔板中分别添加内标工作液；
[0025](3)封板后涡旋混匀并离心，得到第二上清液和第三上清液；
[0026](4)分别吸取该第二上清液和第三上清液，分别添加至第二96孔板中；
[0027](5)在该第二96孔板中分别添加第一溶剂；
[0028](6)封板后涡旋混匀并离心，得到第四上清液和第五上清液；
[0029](7)对该第四上清液和该第五上清液进行该液相色谱
‑
质谱联用分析，得到数据；以及
[0030](8)使用内标法对该数据进行处理，分别以该有效成分的浓度为横坐标，该有效成分和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到该有效成分的标准曲线。
[0031]进一步地，该校正标示样品的制备包括以下步骤：
[0032](1)称量适量的有效成分，用第二溶剂溶解得到1mg/mL的有效成分储备液，将该有
效成分储备液用第二溶剂稀释成梯度浓度400～4*105ng/mL的校正标示样品工作液；以及
[0033](2)将该校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的该校正标示样品，该空白基质为不含该有效成分的该哺乳动物的血浆；
[0034]进一步地，该质控样品的制备包括以下步骤：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定血液中扶正化瘀制剂有效成分浓度的方法，所述方法包括以下步骤：(1)待测样本预处理，获取待测液；(2)有效成分标准曲线制备；以及(3)液相色谱
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质谱联用检测所述待测液中所述有效成分浓度，其中，所述液相色谱
‑
质谱联用的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，流动相：水相(A)为酸水溶液，有机相(B)为甲醇或乙腈；洗脱方式：采用以下梯度程序洗脱：0
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12min，5％B；12
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14min，95％B；14
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16min，5％B；其中，所述液相色谱
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质谱联用的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正负离子模式检测，质量扫描范围m/z 100
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800；其中，所述有效成分为以下中的一种或多种：五味子醇乙、五味子甲素、丹酚酸D、咖啡酸和染料木素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为哺乳动物的血浆；优选地，所述哺乳动物为大鼠、小鼠或犬。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括以下步骤：(1)吸取所述待测样本，添加至第一96孔板中；(2)在所述第一96孔板中添加内标工作液；(3)封板后涡旋混匀并离心，得到第一上清液；(4)吸取所述第一上清液，添加至第二96孔板中；(5)在所述第二96孔板中添加第一溶剂；以及(6)封板后涡旋混匀并离心，得到所述待测液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效成分标准曲线制备包括以下步骤：(1)分别吸取校正标示样品和质控样品，分别添加至第一96孔板中；(2)在所述第一96孔板中分别添加内标工作液；(3)封板后涡旋混匀并离心，得到第二上清液和第三上清液；(4)分别吸取所述第二上清液和第三上清液，分别添加至第二96孔板中；(5)在所述第二96孔板中分别添加第一溶剂；(6)封板后涡旋混匀并离心，得到第四上清液和第五上清液；(7)对所述第四上清液和所述第五上清液进行所述液相色谱
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质谱联用分析，得到数据；以及(8)使用内标法对所述数据进行处理，分别以所述有效成分的浓度为横坐标，所述有效成分和柳胺酚的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述有效成分的标准曲线。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述校正标示样品的制备包括以下步骤：(1)称量适量的有效成分，用第二溶剂溶解得到1mg/mL的有效成分储备液，将所述有效成分储备液用第二溶剂稀释成梯度浓度400～4*105ng/mL的校正标示样品工作液；以及(2)将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样品，所述空白基质为不含所述有效成分的所述哺乳动物的血浆；
优选地，所述质控样品的制备包括以下步骤：(1)称量适量的有效成分，用第二溶剂溶解得到1mg/mL的有效成分储备液，将所述有效成分储备液用第二溶剂稀释成梯度浓度400～3*105ng/mL的质控工作液；以及(2)将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品，所述空白基质为不含所述有效成分的所述哺乳动物的血浆；更优选地，所述内标工作液的制备包括以下步骤：称量适量的柳胺酚，用第二溶剂溶解得到1mg/mL的柳胺酚储备液，将所述柳胺酚储备液用第二溶剂稀释浓度为200ng/mL和50ng/mL的所述内标工作液；特别优选地，所述第一溶剂和所述第二溶剂是相同的或不同的；尤其优选地，所述第一溶剂和所述第二溶剂选自水、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘一峰，杨涛，王玉琳，涂驭斌，李荣胜，
申请(专利权)人：上海黄海制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：