本发明专利技术公开了一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。所述方法包括如下步骤：(1)在基质胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞；(2)更换为含有CHIR99021的细胞培养基培养20～48h；(3)更换为含有维A酸和成纤维生长因子2的细胞培养基培养20～48h；(4)更换为含有激活素A和成纤维生长因子9的细胞培养基培养至少1d，即得细胞外基质。该方法能够高效诱导人源多能干细胞分泌细胞外基质，产量高，产率超过常规方法。且得到的细胞外基质相较于常规方法得到的细胞外基质的蛋白含量更高，且富含的蛋白及其他活性物质种类更丰富，具有更广泛的应用前景和更好的实用性。具有更广泛的应用前景和更好的实用性。
【技术实现步骤摘要】
一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用
[0001]本专利技术属于细胞培养
，特别涉及一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。
技术介绍
[0002]细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，其可以构成复杂的网架结构，从而支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质主要由5类物质组成，包括胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，按分布部位划分主要分为基底膜(Basement membrane)和间质基质(Interstitial matrix)。
[0003]诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，又称人诱导性多能干细胞，常简称为iPS细胞(iPSC)，是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞。
[0004]目前，诱导细胞分泌ECM的方法相对单一，无法脱离诱导剂(如抗坏血酸)的使用，而且ECM的产出量和产出效率较低，难以满足工业化生产需求，还有现有技术获得的ECM品质普遍较差，蛋白含量，尤其是胶原蛋白含量较少，在利用EMC制备胶原蛋白等方面不具有可应用性。
技术实现思路
[0005]本专利技术旨在解决诱导细胞分泌EMC，其EMC产量少，蛋白含量低的技术问题。为此，本专利技术提出一种诱导细胞分泌细胞外基质的方法及其应用。本专利技术中的方法基于特定的诱导剂组合和诱导步骤，能够高效诱导人源干细胞分泌细胞外基质，其分泌量大，分泌效率高，且得到的ECM中富含大量的蛋白和其他活性物质，包括但不限于胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种诱导干细胞分泌细胞外基质的方法，包括如下步骤：
[0007](1)在基质胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞；
[0008](2)更换为含有GSK
‑
3α/β抑制剂的细胞培养基培养20～48h；
[0009](3)更换为含有维A酸和成纤维生长因子2的细胞培养基培养20～48h；
[0010](4)更换为含有激活素A和成纤维生长因子9和的细胞培养基培养至少1d，即得细胞外基质。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述干细胞包括人源干细胞。
[0012]在本专利技术中，术语“人源干细胞”是指人体干细胞，包括从人类骨髓、脂肪、脐带、胎盘中提取，通过体外提纯、增殖、培养等到的相关干细胞。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述干细胞为人源多能干细胞。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述干细胞为人多能干细胞(iPSC)或人胚胎干细胞
(ESC)。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，步骤(2)中，所述GSK
‑
3α/β抑制剂为CHIR99021，其在干细胞培养基中的终浓度为5～15μM。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中，所述维A酸在细胞培养基中的终浓度为1～10μM。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中，所述成纤维生长因子2在细胞培养基中的终浓度为50ng～200ng/mL。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，步骤(4)中，所述激活素A在细胞培养基中的终浓度为1～10ng/mL。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，步骤(4)中，所述成纤维生长因子9在细胞培养基中的终浓度为50ng～200ng/mL。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞培养基包括RPMI 1640培养基。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述RPMI 1640培养基为w/L
‑
glut RPMI 1640培养基。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他细胞培养基进行替代，包括但不限于w/L
‑
glut RPMI 1640培养基。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述基质胶为干细胞基质胶。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述基质胶为Vitronectin XF胶(胚胎干细胞培养贴壁基质)。当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他干细胞基质胶进行替代，包括但不限于Vitronectin XF胶。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法具体为：
[0025](1)在Vitronectin XF胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞18～24h；
[0026](2)更换为含有5～15μM的CHIR99021的RPMI 1640培养基培养20～48h；
[0027](3)更换为含有1～10μM的维A酸和50ng～200ng/mL的成纤维生长因子2的RPMI 1640培养基培养20～48h；
[0028](4)更换为含有1～10ng/mL的激活素A和50ng～200ng/mL的成纤维生长因子9的RPMI 1640培养基培养至少7d，即得细胞外基质。
[0029]在本专利技术的一些实施方式中，在步骤(4)中，培养液每0.8～1.5天更换1次。
[0030]在本专利技术的一些实施方式中，在步骤(4)中，培养液每1天更换1次。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法还包括在步骤(4)后进行过筛除杂。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，所述过筛除杂的步骤为：过40μm细胞筛，除去滤液。
[0033]在本专利技术中，专利技术人发现使用本专利技术中的方法处理干细胞，能够相比常规方法获得更多的细胞，且细胞产生的细胞外基质的量也显著增加(平均每1000万个细胞生产至少18mg细胞外基质)，从而有效提高了细胞外基质的产出效率并提高了经济价值。
[0034]本专利技术的第二个方面，提供本专利技术第一个方面所述的方法诱导分泌得到的细胞外基质，所述细胞外基质中，其每毫克基质的蛋白含量≥0.15mg。
[0035]在本专利技术中，专利技术人发现使用本专利技术中的方法处理干细胞，其获得的细胞外基质能够相比常规方法获得的细胞外基质分泌更多的蛋白，从而极大地增强了该细胞外基质的实用价值和使用效果。
[0036]在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞外基质中的蛋白浓度大于≥1.60mg/mL。
[0037]在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞外基质中含有胶原蛋白、层粘连蛋白(laminin)和蛋白聚糖(GAG)。
[0038]在本专利技术的一些实施方式中，所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白。
[0039]在本专利技术中，专利技术人发现使用本专利技术中的方法处理干细胞，其获得的细胞外基质中的活性物质丰富，其不仅含有各种胶原蛋白，还含有层粘连蛋白(laminin)和蛋白聚糖(GAG)，具有极高的应用价值。
[0040]本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第二个方面所述的细胞外基质在制备含有胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖中至本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种诱导干细胞分泌细胞外基质的方法，包括如下步骤：(1)在基质胶包被细胞培养容器中使用TeSR1培养基培养细胞；(2)更换为含有GSK
‑
3α/β抑制剂的细胞培养基培养20～48h；(3)更换为含有维A酸和成纤维生长因子2的细胞培养基培养20～48h；(4)更换为含有激活素A和成纤维生长因子9和的细胞培养基培养至少1d，即得细胞外基质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞包括人源干细胞；优选包括人多能干细胞和人胚胎干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述GSK
‑
3α/β抑制剂为CHIR99021，其在细胞培养基中的终浓度为5～15μM。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述维A酸在细胞培养基中的终浓度为1～10μM，所述成纤维生长因子2在细...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈嘉欣，林凯欣，赵喜，郑立新，王恒，邱江，
申请(专利权)人：广州华越肾科再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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