一种尿源性细胞的提取培养方法及其在制备防治肾损伤药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种尿源性细胞的提取培养方法及其在制备防治肾损伤药物中的应用。通过本发明专利技术的细胞提取分离培养方法，从尿液中获得一群高表达PAX2、SOX9、OCT2基因的尿源性细胞，其中，PAX2、SOX9基因是与肾脏发育相关的干性基因，OCT2是肾小管上皮细胞中的与有机阳离子和毒素转运相关的基因。该细胞主要从尿液离心后的悬浮细胞中提取，培养过程中不需要饲养层细胞，细胞形态、生长状态更好；而且该细胞用于治疗肾缺血再灌注时具有较好的治疗效果，可以用于制备防治肾损伤药物，具有较大的应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种尿源性细胞的提取培养方法及其在制备防治肾损伤药物中的应用


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及一种尿源性细胞的提取培养方法及其在制备防治肾损伤药物中的应用。

技术介绍

[0002]人体尿液中比较常见的细胞有红细胞、白细胞(淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞等)、鳞状上皮细胞和肾小管上皮细胞等。尿中所见上皮细胞由肾小管、肾盂、输尿管、膀胱、尿道等处温柔脱落入。近年的研究报告指出，在尿液中还发现了一类细胞群，具有干细胞的生物学特性和分化潜能，称之为尿源性干细胞(urine－derived stem cells，USC)。在不同诱导因子的作用下，USC能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、尿路上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等多种组织。但目前人尿液源性干细胞的来源尚不明确，有研究报道来源于肾脏，也有报道来源于输尿管(周明,孙震晓.人尿源性干细胞的分离培养及应用研究新进展[J].生物化学与生物物理进展,2017,44(12):7.)。综上所述，尿液中的细胞种类繁多，来源不明。
[0003]中国专利文献CN112430567A中公开了一种尿源性肾干细胞的提取和培养方法，收集尿液离心后取细胞沉淀，再经过培养基筛选出具有干性的干细胞；但其培养过程需要用到滋养层细胞。中国专利文献CN110305835A中公开了尿源细胞的制备方法，收集尿液离心后取细胞沉淀，再经过培养基筛选出表达nephrin和WT1的尿源性细胞；但相对本专利技术的检测结果而言，其并未说明这种细胞是否高表达PAX2、SOX9、OCT2基因。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种细胞提取分离培养筛选方法，从健康人尿液中获得一群高表达PAX2、SOX9、OCT2基因的尿源性细胞。该方法无需要饲养层细胞，成本较低，而且该方法获得的尿源性细胞相对于其它尿液来源细胞，其PAX2、SOX9、OCT2基因相对表达量更高，用于治疗肾缺血再灌注的效果更好。
[0005]本专利技术所采取的技术方案是：
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种尿源性细胞的培养方法，包含以下步骤：
[0007]S1：收集尿液，去除远离离心管底部部分的上清液，保留靠近离心管底部的剩余上清液和细胞沉淀；
[0008]S2：将步骤S1所述剩余上清液和细胞沉淀中的细胞重悬，过滤后再加入红细胞裂解液进行裂解；
[0009]S3：裂解完毕后离心，然后去除远离离心管底部部分上清液，将剩余的上清液和/或细胞沉淀加培养基混匀后进行培养得第0代尿源性细胞。
[0010]本专利技术发现，离心处理后沉淀细胞SOX9表达量低，注射于肾缺血模型中的治疗效果比较差，而悬浮在上清中的细胞SOX9表达量高，注射于肾缺血模型中的治疗效果比较好。
因此，本专利技术主要获取离心后悬浮液中的细胞，细胞形态、生长状态更好，而且PAX2、OCT2、SOX9表达量高，注射于肾缺血模型中的治疗效果也较好。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S1所述的去除的远离离心管底部的部分上清液占上清液总体积的75％
‑
85％，剩余上清液15％
‑
25％。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S3所述的去除远离离心管底部的部分上清液占上清液总体积的75％
‑
85％，剩余上清液15％
‑
25％。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述离心条件为：离心力350
×
g～450
×
g，离心时间8～15min，离心温度20～25℃；优选为400
×
g，10min，20℃。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述裂解液裂解的条件为：室温静置1～5min；优选为5min。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述过滤的孔径为30～50μm，优选为40μm。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述培养基包含REGM和MEF。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述REGM和MEF的体积比为1:0.5～2，优选为1:1。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述培养的环境条件为36～37℃、5％CO2；优选为37℃、5％CO2。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S3所述的培养的时间≥5天，优选为5～20天，培养基具有筛选功能，在5天后，不适合该培养基的细胞都会死，漂浮起来；在13天后，可保证获得的第0代细胞融合度达到90％以上，随后可传代。本专利技术曾尝试mTeSR1、A1640等培养基，均不能将高表达PAX2、SOX9、OCT2基因尿源性细胞培养起来，而本专利技术所述REGM和MEF培养基能保证每批次高表达PAX2、SOX9、OCT2基因尿源性细胞的成功培养、扩增，故选择该培养基进行培养。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，培养至所述尿源性干细胞密度为80％～90％汇合时可进行传代。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，传代密度为1.0
×
(106～107)/T75瓶。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述传代过程中，每隔2～3天换液；换液方式为50％～100％换液，优选为100％换液。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述尿液为健康人的中段尿液。
[0024]本专利技术的第二方面，提供本专利技术第一方面所述的培养方法制备的尿源性细胞在制备药物筛选模型、药物毒性评价、细胞治疗、细胞药物制备和肾脏组织工程中应用。
[0025]本专利技术的第三方面，提供本专利技术第一方面所述的培养方法制备的尿源性细胞在制备防治肾损伤的产品中的应用。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述肾损伤包括急性肾损伤。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述急性肾损伤包括肾脏缺血
‑
再灌注损伤。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述产品包括药物。
[0029]本专利技术的有益效果是：
[0030]通过本专利技术的细胞提取分离培养筛选方法，从尿液中获得一群高表达PAX2、SOX9、OCT2基因的尿源性细胞，其中，PAX2、SOX9基因是与肾脏发育相关的干性基因，OCT2是肾小管上皮细胞的与有机阳离子和毒素转运相关的基因。该细胞主要从尿液离心后的悬浮细胞中提取，培养过程中无需要饲养层细胞，细胞形态、生长状态更好；而且该细胞用于治疗肾
缺血再灌注时具有良好的治疗效果，可以用于制备防治肾损伤药物，具有较大的应用价值。
附图说明
[0031]图1为实施例1中的P0代细胞。
[0032]图2为实施例2中的P0代细胞。
[0033]图3为对比例1中的P0代细胞。
[0034]图4为对比例2中的P0代细胞。
[0035]图5为实施例1的P3代细胞对部分与肾脏有关的基因的表达量。
[0036]图6为实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿源性细胞的提取、培养筛选方法，包含以下步骤：S1：收集尿液；离心后去除远离离心管底部部分的上清液，保留靠近离心管底部的剩余上清液和细胞沉淀；S2：将步骤S1所述剩余上清液和细胞沉淀中的细胞重悬，过滤后再加入红细胞裂解液进行裂解；S3：裂解完毕后离心，然后去除远离离心管底部部分的上清液，将剩余的上清液和/或细胞沉淀加培养基混匀后进行培养得第0代尿源性细胞；所述离心的条件为：350
×
g～450
×
g、8～15min、20～25℃。2.根据权利要求1所述的提取、培养筛选方法，其特征在于，步骤S1和步骤S3中所述的去除的远离离心管底部的部分上清液占上清液总体积的75％
‑
85％。3.根据权利要求1所述的提取、培养筛选方法，其特征在于，步骤S2所述的加入红细胞裂解液进行裂解红细胞的裂解条件为：加入裂解液后室...

【专利技术属性】
技术研发人员：邝源源，龙晓君，樊琛语，郑佳佳，曾蕴锶，危玉回，郑立新，王恒，邱江，
申请(专利权)人：广州华越肾科再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：