一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法技术

本发明专利技术属于免疫调节剂技术领域，具体涉及一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，新冠病毒S蛋白抗原稀释后加入维生素A、维生素C，再混合弗氏佐剂，并以具有冷冻搅拌头的电动搅拌器搅拌乳化得到，避免了混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活，延长了新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物在免疫体体内的存留时间，得到了较高产量的高效价羊抗新冠病毒S蛋白抗体，且通过本发明专利技术方法制备的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化完全，3000rcf/min离心25min，未见油水分层现象，具有优异的稳定性。具有优异的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法


[0001]本专利技术属于免疫调节剂
，具体涉及一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒（SARS
‑
CoV
‑
2）的主要编码S蛋白是新型冠状病毒疫苗的主要靶蛋白，针对新冠病毒S蛋白的特异性抗体可以应用到目前各种新冠病毒检测卡及新冠病毒检测试剂盒中，实现快速、有效、准确地对新冠病毒进行检测。
[0003]在新冠病毒S蛋白的人工免疫诱导实验中，最常用的佐剂是弗氏佐剂，免疫注射抗原制备时，常将佐剂与抗原溶液按比例混合进行乳化，以增强抗原诱导机体发生的免疫反应，获得高效价抗体。因此，抗原溶剂、乳化程度的可控性、乳化器材质、环境温度等因素对抗原乳化效果有重大影响。
[0004]目前已有报道，去离子水和PBS缓冲液都可以作为抗原乳化的溶剂，且在乳化过程中不改变抗原的结构和免疫原性，以去离子水为溶剂抗原乳化，便于人工控制，但乳化时间相对较长，冰浴条件下的乳化操作较繁琐；以PBS缓冲液为溶剂进行乳化，乳化时间短（2~5min），但容易乳化过度，难以人工控制。
[0005]此外，除了抗原溶剂，对佐剂与抗原乳化的方法也有大量的研究报道；例如，传统乳化法主要有：
①
研磨法：先将佐剂放入玻璃研钵，滴入抗原溶液，边滴边研磨，使之成为油包水乳剂，该法适于制备大量的佐剂抗原，缺点抗原损失大，对微量或昂贵的新冠病毒S蛋白抗原不宜采用。
②
注射器混合法：将弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，交替推动针管，形成粘稠乳剂，该法容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但耗时长，难以乳化完全，对于粘稠度大的新冠病毒S蛋白抗原，用塑料注射器推动困难，而用玻璃注射器又有渗漏，易发生胶管脱落或者劳累和烦躁发生崩漏事故，前功尽弃。
③
超声混合法：将抗原和佐剂于超声波粉碎器上，超声乳化3~4次即可完全乳化，该法的优点是简单、快速、节省材料，但是超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。所以现行的乳化绝大多数使用电动高频的乳化器或大型乳化仪，但针对高分子量的蛋白类抗原，尤其是新冠病毒S蛋白，也不可避免的存在乳化过度的情况。
[0006]因此，对于如何从根本上解决乳化问题，寻求一种各方面优异的乳化方法来制备抗原佐剂乳化物，提高获得的抗体效价是本领域亟待解决的重点问题。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，新冠病毒S蛋白抗原稀释后加入维生素A、维生素C，再混合弗氏佐剂，并以具有冷冻搅拌头的电动搅拌器搅拌乳化得到新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，避免混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活，延长了新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物在免疫体体内的存留时间，得到了较高产量的高效价羊抗新冠病毒S蛋白抗体。
[0008]具体的，本专利技术的技术方案如下：一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，包括如下步骤：（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C，按2~5mg/mL加入维生素A，冰浴，超声溶解，得到抗原稀释液；（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；（3）使用电动搅拌器搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液。
[0009]所述电动搅拌器包括搅拌头，搅拌乳化时，将所述搅拌头
‑
20~
‑
10℃下冷冻10~20min后使用。
[0010]进一步的，（1）中，所述超声溶解的超声频率为25KHz，超声时间为10s。
[0011]进一步的，使用电动搅拌器搅拌乳化的搅拌速度为80~120r/min。
[0012]进一步的，（3）中，所述电动搅拌器包括搅拌头，所述搅拌头为中空管，一端可拆卸连接电动搅拌器的输出端，另一端为圆环状或L状，圆环状或L状显著扩大搅拌头的乳化面积，适用于不同的容器，圆环状搅拌头更适用于离心管，避免触碰管壁，L状搅拌头更适合于敞口较大的容器进行乳化。
[0013]进一步的，（3）中，搅拌乳化时，将所述搅拌头灭菌处理，
‑
20~
‑
10℃下冷冻10~15min后使用。
[0014]本专利技术所述的电动搅拌器为本领域任选的具有可满足本专利技术转速要求的输出电机的搅拌器。
[0015]本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术提供的乳化方法，先稀释新冠病毒S蛋白抗原后添加维生素A及维生素C，再混合弗氏佐剂，配合具有冷冻搅拌头的电动搅拌器，上述步骤实现了抗原佐剂乳化物的快速完全乳化，防止了过度乳化现象的发生；2.维生素A及维生素C添加顺序的优势在于：先将维生素A混合于抗原稀释液中，超声溶解，维生素A在溶液中形成球形微粒，便于同弗氏佐剂乳化，维生素C先分散于稀释液有助于清除可能由于超声产生的超负氧离子（O2‑
）、羟自由基(OH
‑
)、有机自由基（R
‑
）和有机过氧基（ROO
‑
）等自由基，避免了抗原的损失；3.本专利技术的方法将乳液的稳定性提高到了新的水平，配合具有冷冻搅拌头的电动搅拌器，避免混匀过程高速旋转产热使新冠病毒S蛋白抗原失活。
具体实施方式
[0016]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0017]以下所述抗原稀释液即新冠病毒S蛋白抗原稀释液。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，步骤如下：（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C、按2~5mg/mL
加入维生素A，冰浴，25KHz超声10s溶解，得到抗原稀释液；（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；（3）电动搅拌器的搅拌头高压蒸汽灭菌，
‑
20~
‑
10℃下冷冻10~20min后，80~120r/min搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液。
[0019]优选的，电动搅拌器的搅拌头为中空管，末端为圆环状或L状，中空结构保证了搅拌头维持低温，圆环状或L状显著扩大搅拌头的乳化面积，适用于不同的容器，圆环状搅拌头更适用于离心管，避免触碰管壁，L状搅拌头更适合于敞口较大的容器进行乳化。
[0020]对实施例制备得到的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物进行乳化时间对比实验、稳定性实验，对抗原佐剂乳化物免疫得到的血清抗体进行效价实验；上述实验表明，本专利技术的乳化方法制备得到的新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物，具有乳化时间短、保存稳定、免疫产生的血清抗体效价高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）新冠病毒S蛋白抗原用PBS缓冲液稀释，按3~5mg/mL加入维生素C，按2~5mg/mL加入维生素A，冰浴，超声溶解，得到抗原稀释液；（2）抗原稀释液混合等体积的弗氏佐剂，冰浴；（3）使用电动搅拌器搅拌乳化1~10min，完成乳化，得到白色乳液；所述电动搅拌器包括搅拌头，搅拌乳化时，将所述搅拌头
‑
20~
‑
10℃下冷冻10~20min后使用。2.如权利要求1所述的一种新冠病毒S蛋白抗原佐剂乳化物的乳化方法，其特征在于，（1）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：寇增强，胡晓飞，高洋，邵丹，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：