一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法技术

本发明专利技术属于生物传感技术领域，具体提供一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，用以实现快速、高灵敏的双标志物检测；从基本工作原理上讲：混合样本溶液中依次加入第一抗原、第二抗原对应抗体后，激光强度两次降低，最终通过光微流激光强度积分值表征；本发明专利技术创造性的构建了针对两种抗原的先验联合传感图谱，将测量得到的光微流激光强度积分值带入先验联合传感图谱，直接得到第一抗原与第二抗原的浓度，检测灵敏度高；并且，整个检测过程在25分钟内，检测速度极快；同时，具有操作简单、流程清楚、更少试剂用量与样本量等优势；另外，本发明专利技术具有普遍适用性，能够应用到不同蛋白质检测中，还具有强特异性。还具有强特异性。还具有强特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法


[0001]本专利技术属于生物传感
，涉及疾病标志物检测，具体提供一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法。

技术介绍

[0002]随着医学和生物分子学的融合发展，重大疾病标志物检测成为了疾病诊断和治疗的重要组成部分；并且，随着越来越多的疾病标志物被发现和研究，疾病与标志物的相互关系也逐渐清晰，疾病与标志物之间不是一一对应关系，往往一种疾病有多种标志物，疾病的发展往往伴随着不同标志物的释放和吸收过程，而同一标志物也可能对应多种疾病；因此，单一疾病标志物检测已不能满足对疾病进行有效诊断的需求。除此之外，通过研究两种不同疾病的代表性标志物可以对疾病与疾病间的作用机理进行研究，因此，双标志物检测方法是具有现实意义的，尤其是快速、高灵敏的双标志物检测方法。
[0003]针对这一需求，被作为金标准的酶联免疫吸附测定(enzyme
‑
linked immunosorbent assay,ELISA)也被广泛应用于标志物检测中，例如文献“X.Wu.,et al."Optofluidic laser for dual
‑
mode sensitive biomolecular detection with a large dynamic range."Nature Communications2014,5,3779”公开了激光ELISA以实现高灵敏标志物检测，对白细胞介素
‑
6探测极限达到了1fg/ml(38aM)，但是该方法需要繁琐的前期处理过程和较为昂贵的标记试剂，并且预处理时间通常需要几个小时，若ELISA被用于双标志物的检测方案中，对于前期处理的要求更高，时间更长，不利于临床和商业化。
[0004]相比之下，免疫比浊法作为一种无标记免疫分析方法，具有操作简单、快速检测的优势，但较低的检测灵敏度限制了其在标志物检测中的应用；针对这一问题，专利文献CN202010528691.8中通过粒子增强免疫比浊，放大信号，提高灵敏度，但是这种方法还是基于一次透射的光损耗，并不能从原理上对灵敏度有质的提升。而将激光引入到免疫比浊法中，是行之有效的方法，例如专利文献CN109490202A中公开了一种基于光微流激光的免疫比浊分析仪，通过激光和腔增强信号，实现高灵敏快速的蛋白质分子检测；进一步的，文献“Yang,X.,et al."Turbidimetric inhibition immunoassay revisited to enhance its sensitivity via an optofluidic laser."Biosensors and Bioelectronics 2019,131 60
‑
66”中演示了免疫球蛋白G的高灵敏、快速检测，但该方法只演示了一种抗原检测，无法实现双标志物联合检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有激光免疫比浊法无法实现双标志物检测问题，提出一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法基于激光免疫比浊法，通过对传感方法的创新改进，实现了快速、高灵敏的双标志物检测，并且具有操作简单、流程清楚、更少试剂用量与样本量等优势。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，基于FP腔的光微流激光系统实现，其特征在于，所述双标志物检测方法具体包括以下步骤：
[0008]步骤1：配制待检测溶液；
[0009]首先，于待检测样品中加入第一抗原对应的第一抗体，并于37℃下孵育5～10分钟，然后，再加入第二抗原对应的第二抗体，并于37℃下孵育5～10分钟；最后，加入罗丹明6G作为激光染料，形成待检测溶液；
[0010]步骤2：采用移液器将待检测溶液拍打均匀，并注射到微流通道中，测量得到光微流激光强度积分值；
[0011]步骤3：将光微流激光强度积分值带入先验已知联合传感图谱，分别得到第一抗原与第二抗原的浓度；所述联合传感图谱为：
[0012][0013]其中，y1与y2为先验选定常数；P1、P2、P3、Q1、Q2、Q3为先验拟合参数，均为常数；F为光微流激光强度积分值，C1为第一抗原浓度，C2为第二抗原浓度。
[0014]进一步的，所述联合传感图谱的计算过程为：
[0015]设置第一抗原浓度的合集为(C
1,1
,C
1,2
,...,C
1,N
)、第二抗原浓度的合集为(C
2,1
,C
2,2
,...,C
1,M
)；固定第一抗原浓度为C
1,n
、n＝1,2,...,N，依次设置第二抗原浓度为(C
2,1
,C
2,2
,...,C
1,M
)，分别测量得到每个浓度组合(C
1,n
,C
2,m
)、m＝1,2,...,M下的光微流激光强度积分值；调节第一抗原浓度，重复此过程，最终测量得到每个浓度组合(C
1,n
,C
2,m
)、n＝1,2,...,N、m＝1,2,...,M下的光微流激光强度积分值；
[0016]在每一个第一抗原浓度下，根据测量数据得到光微流激光强度积分值关于第二抗原浓度的拟合函数关系式：
[0017]F
n
(y)＝K
n
y+B
n
、y＝lgC
2,m
[0018]其中，K
n
、B
n
均表示拟合参数；
[0019]任意选取两个y值：y＝y1、y＝y2，在y＝y1、y＝y2下，根据拟合光微流激光强度积分值F
n
(y1)、F
n
(y2)，分别得到F
n
(y1)、F
n
(y2)关于第一抗原浓度的拟合函数关系式：
[0020]F
n
(y1)＝P1x+Q1、F
n
(y2)＝P2x+Q2、x＝lgC
1,n
[0021]则得到先验拟合参数P1、P2、Q1、Q2；
[0022]再根据拟合参数B
n
得到B
n
关于第一抗原浓度的拟合函数关系式：
[0023]B
n
＝P3x+Q3[0024]则得到先验拟合参数P3、Q3；
[0025]最终，得到光微流激光强度积分值关于第一抗原浓度与第二抗原浓度的联合传感图谱：
[0026][0027]其中，F为光微流激光强度积分值，C1为第一抗原浓度，C2为第二抗原浓度。
[0028]进一步的，待检测溶液中，第一抗体与第二抗体均保持过量、以确保免疫复合物的大小与体积同抗原浓度正相关，罗丹明浓度为0.16mM。
[0029]进一步的，所述基于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，基于FP腔的光微流激光系统实现，其特征在于，所述双标志物检测方法具体包括以下步骤：步骤1：配制待检测溶液；首先，于待检测样品中加入第一抗原对应的第一抗体，并于37℃下孵育5～10分钟，然后，再加入第二抗原对应的第二抗体，并于37℃下孵育5～10分钟；最后，加入罗丹明6G作为激光染料，形成待检测溶液；步骤2：采用移液器将待检测溶液拍打均匀，并注射到微流通道中，测量得到光微流激光强度积分值；步骤3：将光微流激光强度积分值带入先验已知联合传感图谱，分别得到第一抗原与第二抗原的浓度。2.按权利要求1所述基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，其特征在于，所述联合传感图谱为：其中，y1与y2为先验选定常数；P1、P2、P3、Q1、Q2、Q3为先验拟合参数，均为常数；F为光微流激光强度积分值，C1为第一抗原浓度，C2为第二抗原浓度。3.按权利要求2所述基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，其特征在于，所述联合传感图谱的先验计算过程为：设置第一抗原浓度的合集为(C
1,1
,C
1,2
,...,C
1,N
)、第二抗原浓度的合集为(C
2,1
,C
2,2
,...,C
1,M
)；固定第一抗原浓度为C
1,n
、n＝1,2,...,N，依次设置第二抗原浓度为(C
2,1
,C
2,2
,...,C
1,M
)，分别测量得到每个浓度组合(C
1,n
,C
2,m
)、m＝1,2,...,M下的光微流激光强度积分值；调节第一抗原浓度，重复此过程，最终测量得到每个浓度组合(C
1,n
,C
2,m
)、n＝1,2,...,N、m＝1,2,...,M下的光微流激光强度积分值；在每一个第一抗原浓度下，根据测量数据得到光微流激光强度积分值关于第二抗原浓度的拟合函数关系式：F
n
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艺玲，龚元，王艳琼，张雅馨，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：