一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于赭曲霉毒素A(OTA)检测的级联FRET适配体传感器及方法。包括供体纳米粒子和受体纳米粒子；供体纳米粒子外部修饰OTA适配体(Apt)；受体纳米粒子修饰OTA适配体的互补链，通过OTA适配体与互补链杂交，使受体纳米粒子能接受供体纳米粒子发射的荧光；受体纳米粒子的外部修饰受体荧光基团，能接受受体纳米粒子发射的荧光并实现自身的荧光发射，形成类似于级联传递的FRET传感器；OTA的存在使得适配体与互补链的杂交解离，从而导致供体纳米粒子的荧光无法传递到受体纳米粒子，受体荧光基团不被激发而无荧光发射。根据在供体纳米粒子的激发波长下受体探针上的荧光基团的荧光发射强度，可实现目标物检测。可实现目标物检测。可实现目标物检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器及方法


[0001]本专利技术属于传感器
，具体涉及一种用于赭曲霉毒素A(OTA)检测的级联FRET适配体传感器及方法。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素(Ochratoxins)是主要由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的某些真菌产生的低分子量的次级代谢产物，有A、B、C、D四种化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)。OTA分子式为C
20
H
18
ClNO6，相对分子质量403.8，摩尔消光系数为5550，呈弱酸性，pK
a
为4.4～7.5，是一种稳定的无色结晶化合物，极易溶于极性溶剂，微溶于水。研究表明，OTA在人和动物体内具有蓄积作用，主要靶器官是肾脏，具有很强的肾毒性，并具有潜在的致癌、致畸、致细胞突变的危害，OTA毒性仅次于黄曲霉毒素，国际癌症研究机构(IARC)将其定义为B类(ⅡB
)致癌物。
[0003]OTA广泛存在于食品、饲料及中药材等植物源性产品中，如谷物、咖啡豆、葡萄汁、啤酒、巧克力、乳制品、猪肉制品等食物和饲料中，可以通过食物链进入人和动物体内。。饲料中OTA污染较为严重。近年来报道显示，中药材中也存在OTA污染情况。中药中OTA污染主要存在于根及根茎类、种子果实类和芳香植物中，黄芪、人参、姜黄、连翘、甘草、莲子、麦芽等均被检测出有OTA污染的情况。被污染的中药材，不仅会失去营养及药用价值，而且会对人类的身体健康带来多种危害。鉴于OTA的广泛分布和毒性，许多国家和组织对食品、饲料及中药中OTA制定了严格的限量标准。我国在国标GB 2761
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2017中规定谷物及其制品、豆类及其制品、烘焙咖啡豆、研磨咖啡中OTA限量5μg/kg，葡萄酒OTA限量为2μg/kg，速溶咖啡OTA限量10μg/kg。
[0004]目前，OTA的常规检测方法主要包括：薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(LC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)以及免疫分析法(IA)等。虽然这些方法可实现OTA的检测，但存在一定缺陷：TCL法灵敏度和特异性差；LC和GC法仪器昂贵、依赖专业操作人员；ELISA法易受环境和反应条件影响，稳定性差，存在非特异性反应，检测结果容易出现假阳性问题；CE法重现性差等。因此，研究并建立快速、准确、灵敏的新方法用于OTA污染水平检测很有必要。
[0005]适配体(aptamer)指利用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术在体外从人工合成的随机寡核酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的长度约为25
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80bp的短单链寡核苷酸(DNA或RNA)序列，具有类似单克隆抗体的活性，能与生物分子特异性识别并结合，被称为“化学抗体”。相较于抗体来说，适配体具有稳定性更好、制备更简单的特点，其靶向目标可以是金属离子、小分子、蛋白质、整个细胞等。近年来，适配体生物传感器在食品、中药中的真菌毒素检测领域已取得较多成果。
[0006]荧光共振能量转移(FRET)指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体，Donor)的发射光谱与另一个基团(受体，Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧
光基团间的距离合适时(一般在5～10nm之间)，荧光供体吸收能量到达高电子能态，然后以非辐射性能量跃迁的方式将吸收的能量转移到受体，自身回到基态，并使受体受到激发而发射荧光的现象。通过能量转移后，供体荧光强度降低或完全淬灭，而受体发射出强于自身的特征荧光或作为淬灭剂与发光分子形成不发光的基态络合物。FRET效率与供体发射光谱和受体的特征吸收光谱的重叠程度、供受体空间距离、供体与受体跃迁偶极的相对取向等因素有关。
[0007]荧光聚合物纳米粒子(NPs)是通过将小分子有机染料包埋在聚合物核内或吸附在聚合物核表面而得到的，是一类应用前景广阔的新型荧光探针。由于荧光团被限制在聚合物核内的小空间中，会导致聚集诱导猝灭现象发生(ACQ)。利用体积庞大的疏水反离子使小分子有机染料有机排列，有利于染料分子间能量的级联传递、避免有机染料ACQ，可合成具有强荧光发射的负载染料的纳米粒子。与此同时，反离子能够最大限度地减少染料泄漏，有利于保持聚合物纳米粒子的结构稳定。与无机纳米粒子相比，荧光聚合物纳米粒子具有良好的生物相容性、良好的光稳定性、易于制备和表面功能化、高负载量和良好的可调性。使用负载染料的聚合物纳米粒子作为能量供体，并在其外部耦联由受体染料修饰的DNA，利用内部染料的激发光源进行激发，可通过FRET效应将能量传递到纳米粒子表面的受体染料上，从而构建基于FRET效应的纳米天线。利用纳米粒子外部修饰的DNA作为目标分子的信号探针，通过目标分子调控受体染料的荧光发射，可构建简易的荧光传感器。为了实现高效的FRET，受体染料的吸收光谱与供体染料的发射光谱需高度重叠。而受限于染料分子窄的斯托克斯位移，供体染料的荧光发射谱带与受体染料的荧光发射谱带十分靠近，使得发射的荧光颜色十分接近，难以实现肉眼区分，在成像应用时具有高信噪比。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一种利用聚合物纳米粒子的天线效应和FRET级联传递实现OTA检测的荧光适配体传感器，该传感器包括一组具有天线效应的聚合物纳米粒子、用于OTA识别的核酸适配体及互补链、受体荧光基团、以及相关反应试剂。一组具有天线效应的聚合物纳米粒子，包括两种内部分别包裹不同荧光染料的聚合物纳米粒子
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供体纳米粒子和受体纳米粒子，供体纳米粒子的外部修饰OTA适配体(Apt)，能与受体纳米粒子外部修饰的互补DNA链杂交，使两种纳米粒子的距离足够近；且供体纳米粒子可以作为能量供体，在其激发波长下发射的荧光可使受体纳米粒子的荧光被激发；受体纳米粒子修饰OTA适配体的互补链(即cDNA)，通过OTA适配体与互补链杂交，使受体纳米粒子能接受供体纳米粒子发射的荧光；此外，作为受体的纳米粒子的外部修饰受体荧光基团，能接受受体纳米粒子发射的荧光并实现自身的荧光发射，形成类似于级联传递的FRET传感器；OTA的存在使得适配体与互补链的杂交解离，从而导致供体纳米粒子的荧光无法传递到受体纳米粒子，受体荧光基团不被激发而无荧光发射。根据在供体纳米粒子的激发波长下受体探针上的荧光基团的荧光发射强度，可实现目标物检测。
[0009]本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]一、一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器
[0011]级联FRET适配体传感器由供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子交联得到，供体聚合物纳米粒子修饰有OTA适配体(Apt)，受体聚合物纳米粒子修饰有cDNA和荧光受体
基团。
[0012]二、一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器的制备方法
[0013]包括以下步骤：
[0014]步骤1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，级联FRET适配体传感器由供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子交联得到，供体聚合物纳米粒子修饰有OTA适配体，受体聚合物纳米粒子修饰有cDNA和荧光受体基团。2.根据权利要求1所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，级联FRET适配体传感器的制备方法包括以下步骤：步骤1)分别合成供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子，供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子负载不同荧光染料；步骤2)在供体聚合物纳米粒子上修饰OTA适配体，在受体聚合物纳米粒子上修饰cDNA和受体荧光基团；步骤3)将步骤2的供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子通过DNA杂交实现交联，从而得到用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器。3.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述步骤(1)中：供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子的外壳均为叠氮/羧酸双官能团修饰的PMMA
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AspN3；供体聚合物纳米粒子内部包裹的染料为发射波长在500
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540nm的绿色阳离子染料与反离子的复合物；受体聚合物纳米粒子内部包裹的染料为激发波长在500
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540nm、发射波长在545
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600nm的黄色阳离子染料与反离子的复合物；所述绿色阳离子染料包括罗丹明110、罗丹明Green、罗丹明123中的一种；所述黄色阳离子染料包括罗丹明R18、TAMRA中的一种；所述反离子包括四苯基硼酸酯及其氟化类似物。4.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述供体聚合物纳米粒子或受体聚合物纳米粒子的合成方法具体为：将PMMA
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AspN3溶于乙腈中，在PMMA
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AspN3乙腈溶液中加入阳离子染料和反离子的复合盐，500
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1500rpm转速下震荡后快速加入合成缓冲液，超滤去除乙腈，用合成缓冲液洗涤三次，最终在超滤管中加入合成缓冲液超声1～5min，复溶得到负载染料的供体聚合物纳米粒子或受体聚合物纳米粒子；所述PMMA
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AspN3在乙腈中溶解的浓度为1～5mg/mL；所述复合盐溶于乙腈的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述合成缓冲液的成分包括10
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50mM PBS或Tris，并包含10
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200mM NaCl、0
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30mM MgCl2、0
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30mM CaCl2。5.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述步骤(2)具体为：在供体聚合物纳米粒子上修饰OTA适配体的方法为：将ssDNA与供体聚合物纳米粒子混合后，在25
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50℃温度下不搅拌避光反应5
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24h，降至室温；在受体聚合物纳米粒子上修饰cDNA和受体荧光基团的方法为：将修饰有DBCO基团的ssDNA、红色荧光染料与受体聚合物纳米粒子混合后，在25
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50℃温度下不搅拌避光反应5
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24h，降至室温；所述供体聚合物纳米粒子上修饰的ssDNA包括封闭DNA和OTA适配体，其中封闭DNA与OTA适配体比例为120:1
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60:1之间；
所述受体聚合物纳米粒子上修饰的ssDNA包括封闭DNA和cDNA，其中封闭DNA与cDNA比例为60:1
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20:3之间；所述受体聚合物纳米粒子上修饰的受体荧光基团为荧光发射>610nm的红色荧光染料，包括Cy5
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DBCO、ATTO647...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柳，俞静，徐霞红，何开雨，权浩然，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：