一种检测幽门螺旋杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测幽门螺旋杆菌的方法，使用基于时间分辨荧光微球免疫定量试纸进行检测，包括以下步骤：将时间分辨荧光微球标记的幽门螺旋杆菌标记抗体TRFM

【技术实现步骤摘要】
一种检测幽门螺旋杆菌的方法


[0001]本专利技术涉及免疫荧光层析试纸检测领域，尤其涉及一种检测幽门螺旋杆菌的方法。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。感染幽门螺旋杆菌后，多数人症状较轻或无症状，不加治疗或延缓治疗病情会严重，因此研究幽门螺旋杆菌感染在早期检测具有重要意义。常见感染途径主要是口
‑
口传播和粪
‑
口传播。
[0003]目前，幽门螺旋杆菌可以通过侵入性和非侵入性技术进行诊断。侵入性技术主要利用胃镜取材进行相关检测，包括PCR、组织病理学(细菌培养)、快速尿素酶试验等。这些方法都会给患者带来痛苦，需要较长的培养周期和昂贵的仪器要求，所以其临床推广和随访复查受到限制。非侵入性技术，包括
13
C呼气试验、
14
C呼气试验、粪便抗原检测和血清学抗体检测等，因其无创性而得到应用，但仍存在一些问题，如
14
C 呼气试验放射性强，不适用于孕妇和老人儿童等群体、
13
C呼气试验无放射性，适用于所有人群，但价格昂贵、粪便取样不方便以及抗体检测存在假阳性。
[0004]20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析试纸条检测，操作简便、结果清晰易于判断、无需复杂的实验设备，但是在实际应用中也暴露出一些不足。检测中可能会出现假阳性和假阴性反应，其灵敏度方面存在一定的限制。

技术实现思路

[0005]鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是现有的幽门螺旋杆菌检测方法存在的培养周期长、仪器要求高且仪器昂贵、放射性强、检测取样不方法、检测准确率低及灵敏度低等问题。本专利技术提供了一种检测幽门螺旋杆菌的方法，采用时间分辨荧光微球代替传统的胶体金，用时间分辨荧光微球与幽门螺旋杆菌标记抗体偶联，利用双抗夹心法，将其作为荧光探针用于免疫层析，在波长为365nm的暗箱式紫外分析仪下观察结果，通过拍照后进行Image J软件的分析读取T线强度，实现对唾液中幽门螺旋杆菌的快速定量分析，检测方便且准确率高。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种检测幽门螺旋杆菌的方法，使用基于时间分辨荧光微球免疫定量试纸进行检测，包括以下步骤：
[0007]将时间分辨荧光微球标记的幽门螺旋杆菌标记抗体TRFM
‑
H.pylori
‑
mAb和唾液混合均匀，孵育，得到待测溶液；
[0008]将待测溶液加入时间分辨荧光微球免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，然后用暗箱式紫外分析仪照射试纸条并拍照，最后用Image J软件分析荧光免疫定量试纸条上的T线强度；
[0009]将测得的T线强度代入标准曲线，得到唾液中的幽门螺旋杆菌的浓度。
[0010]进一步地，时间分辨荧光微球标记的幽门螺旋杆菌标记抗体TRFM
‑
H.pylori
‑
mAb 和唾液的体积比设置为1
‑
7:60。
[0011]进一步地，孵育设置为在室温下孵育1
‑
5min。
[0012]进一步地，暗箱式紫外分析仪波长设置为365nm。
[0013]进一步地，时间分辨荧光微球免疫定量试纸包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫设置在PVC底板的上方，样品垫和吸水垫分别设置在硝酸纤维素膜的两端并分别与硝酸纤维素膜的两端相互重叠连接，硝酸纤维素膜上设有幽门螺旋杆菌包被抗体的检测线以及羊抗鼠IgG抗体的质控线。
[0014]进一步地，样品垫的制备方法包括以下步骤：
[0015]首先，制备样品垫处理液，样品垫处理液设置为包括曲拉通X
‑
100和NaCl的 Tris
‑
HCl缓冲液；
[0016]将样品垫浸泡于样品垫处理液中2h后，37℃烘干5
‑
6h，获得样品垫。
[0017]进一步地，样品垫的长为300mm，宽为22mm；硝酸纤维素膜的长为300mm，宽为25mm；吸水垫的长为300mm，宽为18mm。
[0018]进一步地，时间分辨荧光微球设置为羧基水溶性时间分辨荧光微球，大小为300 nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
[0019]进一步地，时间分辨荧光微球免疫定量试纸的制备方法包括以下步骤：
[0020]将0.1
‑
0.5mg/mL的幽门螺旋包被抗体溶液喷涂到硝酸纤维素膜上作为检测线，将 1mg/mL的羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂到硝酸纤维素膜上作为质控线，37℃干燥2h；其中检测线和质控线的距离为4
‑
5mm；
[0021]之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板组装成试纸条；样品垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，吸水垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上；
[0022]最后，用切条机将粘贴好的板切成约4mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到荧光免疫定量试纸条，4℃密封保存备用。
[0023]进一步地，标准曲线设置为当幽门螺旋杆菌的浓度范围为101‑
105CFU/mL时，其浓度的对数值与T线强度成线性关系，Y＝7355.829LgX
‑
5264.191，其中Y为T 线强度，X为幽门螺旋杆菌的浓度；R2＝0.977，检测限可达到1.05CFU/mL。
[0024]技术效果
[0025]本专利技术的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，能够实现快速定量检测唾液中幽门螺旋杆菌的浓度。当幽门螺旋杆菌的浓度范围为101‑
105CFU/mL时，其浓度的对数值与T线强度成线性关系，Y＝7355.829LgX
‑
5264.191，其中Y为T线强度，X 为幽门螺旋杆菌的浓度；R2＝0.977，检测限可达到1.05CFU/mL。该检测方法具有良好的稳定性，样品添加回收率为81.28％～120.23％，变异系数小于7.13％。
[0026]本专利技术的时间分辨荧光微球免疫定量试纸条具有灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低、耗时短、快速定量检测，市场前景广阔，易推广使用。
[0027]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0028]图1是本专利技术的一个较佳实施例的时间分辨荧光微球免疫定量试纸条的结构示意图；
[0029]图2是本专利技术的一个较佳实施例的时间分辨荧光微球免疫定量试纸的标准曲线示意图；
[0030]图3是本专利技术的一个较佳实施例的时间分辨荧光微球免疫定量试纸的稳定性示意图；
[0031]图4是本专利技术的一个较佳实施例的时间分辨荧光微球免疫定量试纸的特异性实验示意图。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，使用基于时间分辨荧光微球免疫定量试纸进行检测，包括以下步骤：将时间分辨荧光微球标记的幽门螺旋杆菌标记抗体TRFM
‑
H.pylori
‑
mAb和唾液混合均匀，孵育，得到待测溶液；将所述待测溶液加入时间分辨荧光微球免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，然后用暗箱式紫外分析仪照射试纸条并拍照，最后用Image J软件分析荧光免疫定量试纸条上的T线强度；将测得的T线强度代入标准曲线，得到唾液中的幽门螺旋杆菌的浓度。2.如权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，时间分辨荧光微球标记的幽门螺旋杆菌标记抗体TRFM
‑
H.pylori
‑
mAb和唾液的体积比设置为1
‑
7:60。3.如权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，所述孵育设置为在室温下孵育1
‑
5min。4.如权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，所述暗箱式紫外分析仪波长设置为365nm。5.如权利要求1
‑
4任一所述的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球免疫定量试纸包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫设置在所述PVC底板的上方，所述样品垫和所述吸水垫分别设置在所述硝酸纤维素膜的两端并分别与所述硝酸纤维素膜的两端相互重叠连接，所述硝酸纤维素膜上设有幽门螺旋杆菌包被抗体的检测线以及羊抗鼠IgG抗体的质控线。6.如权利要求5所述的一种检测幽门螺旋杆菌的方法，其特征在于，所述样品垫的制备方法包括以下步骤：首先，制...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘战民，陈启明，王祎露，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：