用于从生物流体样品中富集细胞外囊泡的方法技术

本发明专利技术提供了用于从来自受试者的生物流体样品中富集包括外泌体在内的细胞外囊泡(EV)，以及任选地进一步就特异性生物标志物的存在情况对所述EV进行测试的方法。存在情况对所述EV进行测试的方法。存在情况对所述EV进行测试的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从生物流体样品中富集细胞外囊泡的方法


[0001]本专利技术提供用于从来自受试者的生物流体样品中富集包括外泌体在内的细胞外囊泡(EV)的方法，并任选地进一步测试EV中是否存在特异性生物标记物的方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(EV)为从各种体液中所发现的细胞脱落的细胞颗粒。EV包括例如外泌体(其可以为约40nm至约100nm)、微囊泡(其可以为约100nm至约1μm)和凋亡小体(其可以为约1μm至约5μm)。这些EV已被证明在稳态和致癌过程中于细胞间通讯中起重要作用(Becker等人，2016年综述)。外泌体来自血管腔内囊泡，其是胞吞过程的副产物且存在于细胞质中。一旦这些前体从细胞的质膜中分泌出来，它们就会变成外泌体。微囊泡(有时称为外泌体)直接在质膜上组装，并且可能包含与外泌体(例如四次跨膜蛋白)相似的货物(cargo)和表面标记物。
[0003]EV是异质的，因为它们是从各种组织分泌出来的，甚至那些从单位点分泌的EV也可能是异质的，这取决于它们的起源细胞(cell of origin)。存在诸如(www.evpedia.info)和(www.exocarta.org)之类的数据库，用于对在来自各种来源的EV内发现的分子的广泛谱系进行分类(Mathivanan and Simpson,2009；Kim等人，2015)。但是，关于什么是分离EV(包括外泌体和微囊泡)的最佳技术，存在着诸多争议。绝大多数文献关注的是外泌体，而对微囊泡的研究较少。此外，用于EV分离的技术通常取决于下游应用。差速超速离心法(DUC)是最常用的方法之一(Andre等人，2002；Pisitkun等人，2004)，在这种方法中，随着速度和时间的增加而采用连续的离心步骤。顺序过滤(有或没有超速离心)可用于确保EV的大小特定的分数。此外，如(System Biosciences)和总外泌体分离(Thermo Fisher)之类的商用试剂能够分离这些颗粒。然而，这些方法均未解决如何富集源自某种细胞类型的EV，例如，诸如来自特定细胞类型的血液循环EV。
[0004]本公开尤其提供了新颖的方法，其基于细胞表面标记物的存在从来自哺乳动物受试者的生物流体样品中富集EV，并且用于任选地进一步测试分离的EV中是否存在其他生物标记物，例如可能在EV的表面上或在内腔中发现的以及可能与特定细胞类型或疾病状态相关的生物标记物。从肿瘤中脱落的EV，例如，包含肿瘤衍生的蛋白质和核酸(Rabinowits等人，2009；Inal等人，2013)。特异地富集这些的能力将使随时间的变化以及跨多个转移灶的液体活体组织切片中的肿瘤特异性信息的研究成为可能。

技术实现思路

[0005]在一些实施例中，本公开涉及富集来自受试者的生物流体样品中的细胞外囊泡(EV)的方法。在一些实施例中，EV是细胞类型特异性的。在一些实施例中，该方法包括(a)提供来自受试者的生物流体样品；(b)使样品与对一种或多种细胞类型的细胞表面标记物具有特异性的抗体接触，任选地，其中该抗体附着于基质；(c)将抗体结合的EV与样品的未结合的EV分离。在一些实施例中，样品的体积为100μl至7mL、200μl至6.5mL、250μl至6.5mL、
200μl至6mL、250μl至6mL、200μl至5mL、200μl至4mL、200μl至3mL、200μl至2mL、100μl至1mL、150μl至1mL、200μl至1mL、250μl至1mL、200μl至500μl、200μl至500μl、200μl至400μl、250μl至500μl或250μl至400μl。在以上任何方法中，EV均可包含来自以下项的EV：上皮细胞、肺组织细胞、乳腺组织细胞、肝组织细胞、前列腺组织细胞、肾组织细胞、尿道细胞、神经细胞、肿瘤细胞、实体瘤细胞、肺肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、肝细胞瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞、泌尿系统肿瘤细胞、胶质母细胞瘤(glioblastoma)细胞或β
‑
淀粉样蛋白表达细胞。在一些实施例中，细胞表面标记物为上皮细胞表面标记物。在一些实施例中，细胞表面标记物可以为(a)上皮细胞表面标记物，诸如EpCAM、EGFR、PSMA、GSP64、CD3、CD49b、CD87、CD95、E
‑
钙粘蛋白CA9、CA12、N
‑
钙粘蛋白、OB
‑
钙粘蛋白、钙粘蛋白
‑
11、细胞角蛋白或上皮膜抗原(EMA)；(b)肺组织标记物，诸如EpCAM、CA9、CA12、DSG3、FAT2、GPR87、KISS1R、LYPD3、SLC7A11、TMPRSS4、CD133、prominin
‑
1、AC133、程序性死亡1受体(PD1)或FAS；(c)乳腺组织标记物，诸如E
‑
钙粘蛋白、上皮膜抗原(EMA)、人表皮生长因子受体2型(Her2/neu)、αvβ6整合素、EpCAM、癌胚抗原(CEA)、叶酸受体
‑
α(FR
‑
α)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)或胎盘特异性蛋白1(PLAC1)；(d)肝细胞标记物，诸如CD133、Prominin
‑
1、CD44、EpCAM、类δ1非典型Notch配体1(DLK1)、ALDH、CD13、CD90、CD24、OV6、ICAM
‑
1、CD34、C
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kit、α2δ1、K19、LGR5、GPC3、膜联蛋白(Annexin)A2、CD15、ABC转运蛋白、Nope、DCLK1、ASGPR、CK或CD47；(e)胶质母细胞瘤生物标记物，诸如纤连蛋白、CD63、HSP70、膜联蛋白A2、CD9、CD81、CD44、GRP78、CD133、CD15、唾液酸糖蛋白(sialoglycoprotein)、SLC1A3、PTPRZ1、GPR56、CLU或ALD1A3；(f)尿道细胞标记物，诸如四次跨膜蛋白、CD9、CD81、LAMP
‑
1、CD10、CD24、CD44或CD63；(g)淀粉样蛋白标记物，诸如β
‑
淀粉样蛋白前体蛋白(β
‑
APP)、早老素蛋白PS
‑
1或胰岛素原蛋白PS
‑
2。在一些实施例中，细胞表面标记物可以为EpCAM。
[0006]在一些实施例中，其中抗体附着于基质，该基质可包含任选地具有磁性的颗粒，诸如珠粒、丸粒或圆片。在一些实施例中，生物流体样品可以包括眼泪、唾液、淋巴液、尿液、血清、脑脊液、胸腔积液、腹水或血浆。在一些实施例中，样品包含血清或血浆。
[0007]在以上任何方法中，受试者可以是人。在一些实施例中，受试者可以为癌症受试者或疑似癌症受试者。在一些实施例中，癌症为实体瘤。在一些实施例中，癌症为乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌、NSCLC、SCLC、肝癌、尿道癌、膀胱癌、脑癌或神经胶质母细胞瘤。在一些实施例中，受试者可以为感染性疾病受试者或疑似感染性疾病受试者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在来自受试者的生物流体样品中富集细胞类型特异性细胞外囊泡(EV)的方法，其包括：a.提供来自所述受试者的生物流体样品；b.使所述样品与对一种或多种细胞类型的细胞表面标志物具有特异性的抗体接触，任选地，其中所述抗体附着于基质；以及c.将所述样品的抗体
‑
结合的EV与未结合的EV分离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的体积为100μl至7mL、200μl至6.5mL、250μl至6.5mL、200μl至6mL、250μl至6mL、200μl至5mL、200μl至4mL、200μl至3mL、200μl至2mL、100μl至1mL、150μl至1mL、200μl至1mL、250μl至1mL、200μl至500μl、200μl至500μl、200μl至400μl、250μl至500μl或250μl至400μl。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述EV包括来自以下项的EV：上皮细胞、肺组织细胞、乳腺组织细胞、肝组织细胞、前列腺组织细胞、肾组织细胞、尿道细胞、神经细胞、肿瘤细胞、实体瘤细胞、肺肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、肝肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞、泌尿系统肿瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞或β
‑
淀粉样蛋白表达细胞。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述细胞表面标志物为上皮细胞表面标志物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物为：a.上皮细胞表面标志物，诸如EpCAM、EGFR、PSMA、GSP64、CD3、CD49b、CD87、CD95、E
‑
钙粘蛋白CA9、CA12、N
‑
钙粘蛋白、OB
‑
钙粘蛋白、钙粘蛋白
‑
11、细胞角蛋白或上皮膜抗原(EMA)；b.肺组织标志物，诸如EpCAM、CA9、CA12、DSG3、FAT2、GPR87、KISS1R、LYPD3、SLC7A11、TMPRSS4、CD133、prominin
‑
1、AC133、程序性死亡1受体(PD1)或FAS；c.乳腺组织标志物，诸如E
‑
钙粘蛋白、上皮膜抗原(EMA)、人表皮生长因子受体2型(Her2/neu)、αvβ6整联蛋白、EpCAM、癌胚抗原(CEA)、叶酸受体
‑
α(FR
‑
α)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)或胎盘特异性蛋白1(PLAC1)；d.肝细胞标志物，诸如CD133、Prominin
‑
1、CD44、EpCAM、δ样1非经典Notch配体1(DLK1)、ALDH、CD13、CD90、CD24、OV6、ICAM
‑
1、CD34、C
‑
kit、α2δ1、K19、LGR5、GPC3、膜联蛋白A2、CD15、ABC转运蛋白、Nope、DCLK1、ASGPR、CK或CD47；e.胶质母细胞瘤生物标志物，诸如纤连蛋白、CD63、HSP70、膜联蛋白A2、CD9、CD81、CD44、GRP78、CD133、CD15、唾液酸糖蛋白、SLC1A3、PTPRZ1、GPR56、CLU或ALD1A3；f.尿道细胞标志物，诸如四跨膜蛋白、CD9、CD81、LAMP
‑
1、CD10、CD24、CD44或CD63；或g.淀粉样蛋白标志物，诸如β
‑
淀粉样前体蛋白(β
‑
APP)、早老素蛋白PS
‑
1或胰岛素原蛋白PS
‑
2。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述基质包括任选地具有磁性的颗粒，诸如珠粒、丸粒或芯片。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述生物流体样品包括眼泪、唾液、淋巴液、尿液、血清、脑脊髓液、胸腔积液、腹水或血浆。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述样品包含血清或血浆。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为癌症受试者或疑似癌
症受试者。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌、NSCLC、SCLC、肝癌、尿道癌症、膀胱癌、脑癌或胶质母细胞瘤。13.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为感染性疾病受试者或疑似感染性疾病受试者。14.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为炎性疾病受试者或疑似炎性疾病受试者。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物为EpCAM。16.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为淀粉样蛋白疾病受试者或疑似淀粉样蛋白疾病受试者。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其进一步包括从所述样品中分离总细胞外囊泡(EV)，诸如通过膜捕获或差速超速离心；确定分离的总细胞外囊泡中的总蛋白水平；以及任选地将来自所述总EV的所述总蛋白水平与所述EV中细胞表面标志物的水平进行比较。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中抗体结合的EV与未结合的EV的分离是通过附着于所述基质进行的。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体结合的EV与所述未结合的EV的分离包括将所述基质与所述样品中的上清液分离，例如通过使所述基质借由重力或离心进行沉淀。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其进一步包括使所述抗体结合的EV与对第二生物标志物具有特异性的检测剂接触。21.根据权利要求20所述的方法，其中在与所述对第二生物标志物具有特异性的检测剂接触之前，所述抗体结合的EV被重悬于裂解缓冲液中。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述检测剂为抗体。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述第二生物标志物包括蛋白质、多核苷酸(例如RNA分子)、脂质、药物或药物代谢物。24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症或疑似患有癌症，并且其中所述第二生物标志物为在肿瘤细胞中表达或过度表达的多肽，和/或其中所述第二生物标志物为细胞因子、细胞因子受体或免疫检查点调节物。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二生物标志物为以下中的一者或多者：PD
‑
L1、SCF、IL
‑
3、GM
‑
CSF、G
‑
CSF、M
‑
CSF、TNF
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α、IL
‑
2、IL
‑
5、TMB、CTLA
‑
4、ICOS、4
‑
1BB(CD137)、PD
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1、CTLA
‑
4、LAG
‑
3、Tim
‑
3、CD39、IFN
‑
β、IFN
‑
γ、IL
‑
2、IL
‑
10、TGF
‑
β、CCR10、CXCR4、CCR7、sMICA、IL
‑
8、IDO1、GBP1、II类MHC分子、CXCL9、CXCL10(IP
‑
10)、CXCL11、IL
‑
6、CCL4、CCL5、IFNGR1、IFNGR2、JAK2、IRF1、IFIT1、IFIT2、MTAP、miR3、SOCA1、PIAS4、GZMA、GZMB、PRF1、HLA
‑
DQA1、HLA
‑
DRB1、IFNG、STAT1、ICAM1
‑
5、VCAM
‑
1、JAK1、JAK2、CCR5、HLA
‑
DRA、CXCR6、TIGIT、CD27、CD274、PDCD1LG2(PD
‑
L2)、LAG3、NKG7、PSMB10、CMKLR1、CD8A、CD8B、HLA
‑
DB1、HLA
‑
E、CD276、CD3D、CD3E、CD3G、CD247、ZAP70、CD2、CD28、ICOS、IL12Rb1、GZMM、FLTSLG、IL
‑
15、Eotazin、GRO
‑
1、VEGF、HGF、AFP、BCR
‑
ABL、BRCA1/BRCA2、B
‑
Raf V600E、CA
‑
125、CA19
‑
9、CEA、EGFR、HER
‑
2/neu、KIT、PSA、S100、KRAS、UGT1A1或CD20。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法具有以下特征中的一个或多个：
‑
在使所述样品与所述抗体接触之前或之后，所述样品不经受色谱分析；
‑
在使所述样品与所述抗体接触之前，所述样品未经处理，除了任选地去除直径大于1μm、大于2μm、大于5μm、大于10μm或大于20μm的颗粒和/或去除比EV大的细胞体和碎片；
‑
在使所述样品与所述抗体接触之前或之后，所述EV不经受色谱分析；
‑
所述抗体附着于基质，并且所述基质不是过滤器、离子交换介质或膜；或
‑
所述抗体附着于基质，并且所述基质不带电荷。27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中从所述样品中分离所述细胞类型特异性EV基本上由以下项组成：使所述样品与对所述一种或多种细胞类型的所述细胞表面标志物具有特异性的抗体接触，任选地，其中所述抗体附着于基质；以及将所述样品的抗体
‑
结合的EV与未结合的EV分离。28.一种富集来自受试者的细胞类型特异性细胞外囊泡(EV)的方法，其包括：a.提供来自所述受试者的生物流体样品；b.使所述样品与对细胞表面标志物具有特异性的抗体接触，任选地，其中所述抗体附着于基质；c.将所述样品的抗体
‑
结合的EV与未结合的EV分离；d.任选地将所述抗体
‑
结合的EV重悬于裂解缓冲液中；以及e.使所述EV与对第二生物标志物具有特异性的检测剂接触。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述样品的体积为100μl至7mL、200μl至6.5mL、250μl至6.5mL、200μl至6mL、250μl至6mL、200μl至5mL、200μl至4mL、200μl至3mL、200μl至2mL、100μl至1mL、150μl至1mL、200μl至1mL、250μl至1mL、200μl至500μl、200μl至500μl、200μl至400μl、250μl至500μl或250μl至400μl。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述EV包括来自以下项的EV：上皮细胞、肺组织细胞、乳腺组织细胞、肝组织细胞、前列腺组织细胞、肾组织细胞、尿道细胞、神经细胞、肿瘤细胞、实体瘤细胞、肺肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、肝肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞、泌尿系统肿瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞或β
‑
淀粉样蛋白表达细胞。31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物为上皮细胞表面标志物。32.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物为：a.上皮细胞表面标志物，诸如EpCAM、EGFR、PSMA、GSP64、CD3、CD49b、CD87、CD95、E
‑
钙粘蛋白CA9、CA12、N
‑
钙粘蛋白、OB
‑
钙粘蛋白、钙粘蛋白
‑
11、细胞角蛋白或上皮膜抗原(EMA)；b.肺组织标志物，诸如EpCAM、CA9、CA12、DSG3、FAT2、GPR87、KISS1R、LYPD3、SLC7A11、TMPRSS4、CD133、prominin
‑
1、AC133、程序性死亡1受体(PD1)或FAS；c.乳腺组织标志物，诸如E
‑
钙粘蛋白、上皮膜抗原(EMA)、人表皮生长因子受体2型(Her2/neu)、αvβ6整联蛋白、EpCAM、癌胚抗原(CEA)、叶酸受体
‑
α(FR
‑
α)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)或胎盘特异性蛋白1(PLAC1)；d.肝细胞标志物，诸如CD133、Prominin
‑
1、CD44、EpCAM、δ样1非经典Notch配体1
(DLK1)、ALDH、CD13、CD90、CD24、OV6、ICAM
‑
1、CD34、C
‑
kit、α2δ1、K19、LGR5、GPC3、膜联蛋白A2、CD15、ABC转运蛋白、Nope、DCLK1、ASGPR、CK或CD47；e.胶质母细胞瘤生物标志物，诸如纤连蛋白、CD63、HSP70、膜联蛋白A2、CD9、CD81、CD44、GRP78、CD133、CD15、唾液酸糖蛋白、SLC1A3、PTPRZ1、GPR56、CLU或ALD1A3；f.尿道细胞标志物，诸如四跨膜蛋白、CD9、CD81、LAMP
‑
1、CD10、CD24、CD44或CD63；或g.淀粉样蛋白标志物，诸如β
‑
淀粉样前体蛋白(β
‑
APP)、早老素蛋白PS
‑
1或胰岛素原蛋白PS
‑
2。33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述基质包括任选地具有磁性的颗粒，诸如珠粒、丸粒或芯片。34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述生物流体样品包括眼泪、唾液、淋巴液、尿液、血清、脑脊髓液、胸腔积液、腹水或血浆。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述样品包含血清或血浆。36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述受试者为癌症受试者或疑似癌症受试者。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌、NSCLC、SCLC、肝癌、尿道癌症、膀胱癌、脑癌或胶质母细胞瘤。40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述受试者为感染性疾病受试者或疑似感染性疾病受试者。41.根据权利要求40所述的方法，其中(a)所述细胞表面标志物包括EpCAM、EGFR、PSMA、GSP64、CD3、CD49b、CD87、CD95、E
‑
钙粘蛋白CA9、CA12、N
‑
钙粘蛋白、OB
‑
钙粘蛋白、钙粘蛋白
‑
11、细胞角蛋白和上皮膜抗原(EMA)，和/或(b)所述第二生物标志物包括以下中的一者或多者：IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
8、IL
‑
10、IL
‑
35、IFN
‑
α、IFN
‑
γ、CXCL10(IP
‑
10)、C反应蛋白、血凝素、病毒RNA、病毒DNA、病毒蛋白(诸如乙型肝炎表面抗原和HIV p24抗原)、细菌RNA、细菌DNA、细菌蛋白、表面免疫球蛋白或C3补体成分的受体。42.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述受试者为炎性疾病受试者或疑似炎性疾病受试者。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二生物标志物包括以下中的一者或多者：TNF
‑
α、IL
‑
16、IL
‑
17、IL
‑
21、IL
‑
22、IL
‑
33、CD86、CD80、CRP、IL
‑
1、IL
‑
1α、IL
‑
1β、IL
‑
2、IL
‑
6、IL
‑
8、IL
‑
12、IFN
‑
γ、血清淀粉样蛋白(SAA)、COX2、NK
‑
κB、CCL2、CXCL10、CCL2、CXCL5、CXCL9、CXCL6、MMP
‑
7、MMP
‑
2、MMP
‑
9或CSFIR；以及任选地，其中所述细胞表面标志物为上皮细胞表面标志物，诸如EpCAM、EGFR、PSMA、GSP64、CD3、CD49b、CD87、CD95、E
‑
钙粘蛋白CA9、CA12、N
‑
钙粘蛋白、OB
‑
钙粘蛋白、钙粘蛋白
‑
11、细胞角蛋白或上皮膜抗原(EMA)。44.根据权利要求28至43中任一项所述的方法，其中所述细胞表面标志物为EpCAM。45.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述受试者为淀粉样蛋白疾病受试者或疑似淀粉样蛋白疾病受试者。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞表面标志物为β
‑
APP、PS
‑
1或PS
‑
2，和/或其中所述第二生物标志物为以下中的一者或多者：CD3、CD4、CD8、CD40L、CD45RO、CD45RA、
sCD40L、Fas/CD95、CD14、APP、CD19、CD69、IL
‑
2、IFN

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：