单分子成像制造技术

单分子检测包括将单分子结合到光学透明基板的表面，用具有选定的入射角的光照射基板的表面以实现光的全反射，从而散射来自表面和来自结合到表面的单分子的光；并收集由表面和由结合在表面上的单分子散射的光以形成系列图像。用于检测单分子的系统包括光学透明基板，用于使样品溶液流过基板表面的装置，被配置为照射表面的光源，摄像机，和被配置为收集由表面和由表面上的靶分子散射的光以在摄像机上形成系列图像的光学收集系统。机上形成系列图像的光学收集系统。机上形成系列图像的光学收集系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单分子成像
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年2月12日提交的美国专利申请号62/975,473和2021年1月14日提交的美国专利申请号63/137,611的权益。政府利益声明
[0002]这项专利技术是在美国国立卫生研究院授予的R01 GM107165政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。


[0003]本专利技术涉及基于由表面等离子体共振(SPR)或全内反射(TIF)产生的传感器表面附近的倏逝场的散射用于单分子成像和分析的装置、系统和方法。

技术介绍

[0004]无标记光学检测技术通常分为两类：远场(光场可以在超过光波长的数倍的空间中传播)和近场(光场不能在空间中传播，并且位于光波长范围内)。虽然表面等离子共振(SPR)显微镜等近场方法已被用于实现高空间分辨率，但单分子的成像一直难以捉摸。常规SPR或全内反射(TIF)检测反射光，产生强烈的背景，淹没来自单分子的微弱信号。此外，它产生几微米大小的衍射图案，降低图像的空间分辨率。

技术实现思路

[0005]本文所述的近场系统和方法与它们的远场对应物相比具有各种优势。首先，倏逝场(近场)强度位于传感器表面附近，使其表面敏感化，从而减少了本体溶液中分子的干扰。其次，传感器表面附近的场有大幅的增强(20
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30倍)，这有助于(例如，SPR和TIF的)高灵敏度。此外，SPR和TIF的共振条件取决于传感器表面附近的折射率，因此也可以使用相同的设置测量不散射大量光的小分子或离子的结合。
>[0006]此外，本文所述的方法可用于通过数字计数方法评估分子结合动力学，该方法消除了测量表面等离子共振角偏移的需要，并提供结合动力学的精确测量。此处公开的数字计数方法可用于同时确定与传感器表面结合的分子的数量和分子的大小。
[0007]从孤立物体(例如，分子)散射的光随着物体的尺寸减少而迅速下降。在这里，具有适当表面粗糙度水平的传感器用于产生散射光，该散射光干涉从物体散射的光，从而产生比孤立物体的图像对比度下降得更慢的图像对比度。
[0008]散粒噪声是光学成像中的基本限。为了最小化散粒噪声，一种策略是增加入射光强度，这会导致传感器表面上的分子发热。如本文所述，在流体中实施冷却机制以通过调节样品流量来去除热量。
[0009]本公开还描述了等离子体散射显微镜(PSM)，这是一种基于棱镜的SPR系统，其用于通过等离子体散射成像检测单个未标记的蛋白质，其允许在单分子水平上测量单个蛋白质质量和研究分子结合过程。与整体SPR相比，基于单分子的测量可通过量化单个结合分析
物分子的质量和结合动力学来区分特异性和非特异性结合过程。此外，基于棱镜的SPR成本低且机械稳定。
[0010]如本文所述，等离子体散射成像技术可以克服棱镜配置的物理限制，其限制了无标记单分子成像应用的数值孔径和放大率。本文描述了成像设置和检测原理，并通过对不同尺寸的纳米粒子和不同分子质量的蛋白质进行校准来验证检测原理。示出了单蛋白成像以详细揭示特异性和非特异性结合过程。此外，本文所述的系统和方法可以区分具有不同分子量的单个结合蛋白，并且还揭示了特异性和非特异性结合的不同结合行为。这种方法允许在血清等复杂介质中进行无标记结合动力学分析。此外，棱镜耦合的PSM的棱镜配置的刚性机械结构有利于测量重现性，提高系统稳定性，并简化仪器操作。
[0011]PSM利用大等离子体增强作为常规的SPR技术，因此与非等离子体方法相比，具有更低入射光功率或更宽视场的高信噪比。PSM还避免了反射光的收集，因此与常规的SPR成像相比，至少具有三个优点：1)提供更暗的背景，从而提高对比度；2)允许使用高入射光强度来提高信噪比；3)消除了SPRM图像中的抛物线尾部，提高了空间分辨率。此外，PSM方案使用放置在样品顶部的物镜来对分析物散射的表面等离子体波进行成像，而不是使用SPRM中的全内反射荧光(TIRF)物镜来创建反射图像。可用棱镜配置而不是TIRF物镜构建单分子成像系统，以获得更稳定的SPR激发，因为棱镜配置不需要精确控制悬浮盖玻片和充满浸油的TIRF物镜之间的距离，因此不受油漂移的影响，油漂移容易受到环境噪声的影响，其对入射光条件和图像聚焦都有很大影响，这是SPRM中的一个常见问题。基于棱镜的PSM提供了用于详细了解生物过程的单个蛋白质成像能力，以及良好的测量重现性，这至少部分归功于棱镜配置的刚性机械结构。
[0012]尽管所公开的专利技术构思包括在所附权利要求中定义的那些，但是应该理解，本专利技术构思也可以根据以下实施例来定义。
[0013]除了所附权利要求的实施例和上述实施例之外，以下编号的实施例也是具有创造性的。
[0014]实施例1是一种检测单分子的方法，该方法包括：将单分子结合到光学透明基板的表面；用具有选定的入射角的光照射基板的表面以实现所述光的全反射，从而散射来自所述表面和来自结合到所述表面的单分子的光；并收集由表面和由结合在表面上的单分子散射的光以形成系列图像。
[0015]实施例2为实施例1的方法，其中选择所述表面的粗糙度，使得表面产生散射光以充分与由所述单分子散射的光相干涉。
[0016]实施例3为实施例2的方法，其中表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
[0017]实施例4为实施例1至3中任一项的方法，还包括处理系列图像。
[0018]实施例5为实施例4的方法，其中处理系列图像包括：对系列图像中的图像进行平均化；从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和随着时间的推移将差分图像序列积分。
[0019]实施例6为实施例1至5中任一项的方法，还包括计数随着时间的推移与所述表面结合的多个单分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力。
[0020]实施例7为实施例1至6中任一项的方法，还包括校正机械漂移。
[0021]实施例8为实施例7的方法，其中校正机械漂移包括：识别表面的一个或多个特征；
确定每个图像的漂移位移；和从每个图像中减去所述漂移位移。
[0022]实施例9为实施例1至8中任一项的方法，其中光学透明基板涂覆有捕获分子，从而可检测和识别样品溶液中目标分析物的特异性结合。
[0023]实施例10为实施例1至9中任一项的方法，其中所述表面涂覆有金属层，并且选择入射角以在金属层上产生表面等离子体共振。
[0024]实施例11为方法实施例10，其中金属层是金。
[0025]实施例12为实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。
[0026]实施例13为实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。
[0027]实施例14为一种系统，其包括：光学透明的固体基板；用于使样品溶液流过基板表面的装置；光源，其被配置为用具有选定的入射角的光照射表面以实现光的全反射；摄像机；光学收集系统，其被配置为收集由表面和由表面上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测单分子的方法，所述方法包括：将所述单分子结合到光学透明基板的表面；用具有选定的入射角的光照射所述基板的表面以实现所述光的全反射，从而散射来自所述表面和来自结合到所述表面的所述单分子的光；和收集由所述表面和由结合到所述表面的所述单分子散射的光以形成系列图像。2.如权利要求1所述的方法，其中选择所述表面的粗糙度，使得所述表面产生散射光以充分与由所述单分子散射的光相干涉。3.如权利要求2所述的方法，其中所述表面的粗糙度在1nm和100nm之间。4.如权利要求1所述的方法，其中还包括处理所述系列图像。5.如权利要求4所述的方法，其中处理所述系列图像包括：对所述系列图像中的图像进行平均化；从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和随着时间的推移对所述差分图像序列进行积分。6.如权利要求1所述的方法，还包括计数随着时间的推移与所述表面结合的多个单分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力。7.如权利要求1所述的方法，还包括校正机械漂移。8.如权利要求7所述的方法，其中校正机械漂移包括：识别所述表面的一个或多个特征；确定每个图像的漂移位移；和从每个图像中减去所述漂移位移。9.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板涂覆有捕获分子，从而可以检测和识别样品溶液中目标分析物的特异性结合。10.如权利要求1所述的方法，其中所述表面涂覆有金属层，并且选择所述入射角以在所述金属层上产生表面等离子体共振。11.如权利要求10所述的方法，其中所述金属层为金。12.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学物镜。13.如权利要求1所述的方法，其中所述光学透明基板包括附接至具有折射率匹配油的载玻片的光学棱镜。14.一种系统，包括：光学透明的固体基板；用于使样品溶液流过基板的表面的装置；光源，其被配置为用具有选定的入射角的光照射所述表面以实现所述光的全反射；摄像机；和光学收集系统，其被配置为收集由所述表面和由所述表面上的靶分子散射的光，同时避免收集从所述表面反射的光，以在所述摄像机上形成系列图像。15.如权利要求14所述的系统，其中选择所述表面的粗糙度，使得所述表面产生散射光以充分与由所述靶分子散射的光相干涉。16.如权利要求15所述的系统，其中所述表面的粗糙度在1nm和100nm之间。
17.如权利要求14所述的系统，其中用于使样品溶液流过所述基板的表面的装置包括：在所述基板表面上具有入口和出口的流体室；将样品和参考溶液输送到所述基板表面的装置；和调节所述样品和参考溶液流速的装置，以最小化与入射光相关的表面加热。18.如权利要求14所述的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为：对所述系列图像中的图像进行平均化；从每幅图像中减去前一幅图像，形成差分图像序列；和随着时间的推移将所述差分图像序列进行积分。19.如权利要求14所述的系统，其中所述光学收集系统被配置为从入射光和反射光的相对侧收集由所述表面和由所述表面上的所述靶分子散射的光。20.如权利要求14所述的系统，其中所述光学收集系统被配置为从入射光和反射光的同一侧收集由所述表面和由所述表面上的所述靶分子散射的光，但避免收集所述反射光。21.如权利要求14所述的系统，其中所述表面包括被配置为与所述靶分子结合的受体，并且通过随时间计数所述靶分子并与结合模型拟合以确定动力学常数和亲和力来检测所述靶分子的结合和解离。22.如权利要求14所述的系统，还包括控制器，其中所述控制器被配置为校正机械漂移。23.如权利要求22所述的系统，其中校正机械漂移包括：识别所述表面的一个或多个特征；确定每个图像的漂移...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶农建，王少鹏，张鹏飞，
申请(专利权)人：亚利桑那州立大学亚利桑那州董事会，
类型：发明
国别省市：