一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法及其应用，所述肿瘤疫苗包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂DSPE

【技术实现步骤摘要】
一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及疫苗的制备方法和应用，特别是一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]黑色素瘤是一种常发于皮肤，并能产生黑色素的恶性肿瘤，具有高致死率、高侵袭和高转移等典型特性。手术是当前恶性黑色素瘤的主要治疗方式，而放化疗在术后辅助治疗方面效果并不佳。由于黑色素瘤对免疫反应敏感，因此其免疫治疗一直是近年来的研究热点。然而，疫苗作为免疫治疗领域的重要分支，在黑色素瘤中研究甚少。
[0003]肿瘤疫苗的主要机制是诱导肿瘤抗原特异性T细胞的增殖和活化，进而杀伤肿瘤细胞。若要实现抗原特异性T细胞的激活，树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞在提呈肿瘤相关抗原的同时也要处于活化状态。若要达到此种状态，这些抗原提呈细胞需同时接触疫苗的抗原和佐剂，也即是抗原和佐剂需共定位在同一个颗粒上。因此，如何实现抗原和佐剂的稳定整合是目前提高肿瘤疫苗效果的关键所在。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术目的是提供一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗及其制备方法和应用。
[0005]该方法构建一种黑色素瘤细胞膜和细菌外泌体组成的融合膜系统，并在其表面修饰PEG和甘露糖，从而对黑色素瘤的发生起到一定的预防作用。
[0006]技术方案：所述基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗，包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂DSPE
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PEG
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Mannose。
[0007]所述的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)提取黑色素瘤细胞膜；
[0009]2)提取大肠杆菌外泌体；
[0010]3)合成DSPE
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PEG
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Mannose；
[0011]4)将所述步骤1)、2)和3)制成仿生纳米疫苗。
[0012]进一步地，所述步骤1)和2)中黑色素瘤细胞膜和大肠杆菌外泌体的提取方法均采用超速离心法。
[0013]进一步地，所述步骤3)中DSPE
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PEG
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Mannose的合成原料包括：将5mg DSPE
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PEG2000
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NH2与1mg Mannose
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NHS溶于DMSO中，透析，然后将保留液进行冷冻干燥，最终得到DSPE
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PEG
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Mannose。
[0014]进一步地，所述步骤4)中仿生纳米疫苗的制备步骤包括：将黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和DSPE
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PEG
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Mannose在PBS里充分混合均匀；用脂质体挤出器对混合物进行挤压，并依次经过400nm、200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜；透析并收集保留液，调整总蛋白终浓度，过滤除菌，加入青链霉素，即可。
[0015]基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0016]本专利技术所述肿瘤疫苗包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂DSPE
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PEG
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Mannose，其中肿瘤细胞膜包含多种肿瘤特异性抗原，可诱导出多种肿瘤抗原特异性T细胞的增殖和活化，从而增强抗肿瘤效果；细菌外泌体含脂多糖、脂蛋白和糖蛋白等免疫刺激性物质，是有效的生物性佐剂。利用脂质体挤出器将细胞膜和细菌外泌体进行膜融合，并在其表面修饰PEG和甘露糖以增强其稳定性，靶向免疫细胞并刺激其至成熟状态以引发抗肿瘤免疫应答。本专利技术所涉及的仿生纳米疫苗均为非无机材料所组成，尺寸小且具有生物可降解性；制备方法简单，靶向性强，能够激发特异性免疫和非特异性免疫，为发展个性化肿瘤疫苗奠定基础。
[0017]肿瘤细胞膜包含多种肿瘤特异性抗原，可诱导出多种肿瘤抗原特异性T细胞的增殖和活化，从而增强抗肿瘤效果。而细菌外泌体是由细菌自然衍生而来，表面含有多种具有LPS、脂蛋白和糖蛋白等免疫刺激性病原相关分子模式，是一种有效的生物性佐剂。另外，细菌外泌体含有较少的细菌细胞壁刚性结构成分，在与肿瘤细胞膜进行挤出器挤压时容易发生融合或被包埋。本专利技术还在这个混合膜的表面作PEG和甘露糖修饰，使之增强稳定性和免疫细胞靶向性。因此，开发这种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗是可行且有意义的。
[0018]有益效果：本专利技术与现有技术相比，具有如下优势：
[0019]1、本专利技术的仿生纳米疫苗抗原和佐剂共定位在同一个纳米颗粒上，有利于肿瘤抗原的摄取和呈递。
[0020]2、本专利技术的仿生纳米疫苗表面作PEG和甘露糖修饰，有利于疫苗的长期稳定和免疫细胞靶向性。
[0021]3、本专利技术的仿生纳米疫苗尺寸小，有利于疫苗向淋巴结位置迁移。
[0022]4、本专利技术的仿生纳米疫苗在制作过程方面可操作性强，对于适合免疫治疗和抗原特异性强的多种肿瘤，参考本专利技术均可制成相应的肿瘤疫苗。
[0023]5、本专利技术的仿生纳米疫苗在临床上具有一定的应用前景。在手术切除患者的肿瘤后，提取自身肿瘤组织的细胞膜后可参考本专利技术可制成个性化肿瘤疫苗，待患者术后恢复到一定程度后可与临床上的免疫治疗剂开展联合治疗。
附图说明
[0024]图1是仿生纳米疫苗的透射电镜图；
[0025]图2是在小鼠腹股沟附近皮下注射三针仿生纳米疫苗期间的小鼠体重变化曲线图；
[0026]图3是第21天(注射第三针仿生纳米疫苗后的第七天)小鼠心、肝、肺、肾、大脑皮质、淋巴结和肾脏的HE染色结果图；
[0027]图4是荷瘤后的小鼠体重变化曲线图；
[0028]图5是荷瘤后的小鼠肿瘤体积变化曲线图；
[0029]图6是剥离后的肿瘤形态图；
[0030]图7是剥离后的肿瘤重量统计图。
具体实施方式
[0031]实施例一 本实施例的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，包括如下步骤：
[0032]1、黑色素瘤细胞膜的提取
[0033]用预冷的PBS洗涤1次培养瓶中的贴壁细胞。
[0034]用含2mM EDTA的预冷PBS消化细胞20min，使细胞脱壁。
[0035]以7min，680
×
g转速离心收集细胞，弃上清液。
[0036]用PBS重悬细胞并以7min，680
×
g转速离心收集细胞，弃上清。
[0037]用含有蛋白酶抑制剂复合物的低渗裂解液重悬细胞，并在冰浴环境裂解细胞10min。
[0038]在冰浴环境用数控超声波细胞粉碎机对细胞进行机械破坏(超声时间2min，超声功率70W，超声1秒/间隙1秒)，在显微镜下观察细胞是否被完全破碎(如果是，继续下一步；如果否，重复破碎。)。
[0039]用4℃离心机收集细胞(9970
×
g，25min)，并收集上清液，弃沉淀物；
[0040]将上清液转移到超高速离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗，其特征在于，包括黑色素瘤细胞膜、大肠杆菌外泌体和修饰剂DSPE
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PEG
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Mannose。2.权利要求1所述的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取黑色素瘤细胞膜；2)提取大肠杆菌外泌体；3)合成DSPE
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PEG
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Mannose；4)将所述步骤1)、2)和3)制成仿生纳米疫苗。3.根据权利要求1所述的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤1)和2)中黑色素瘤细胞膜和大肠杆菌外泌体的提取方法均采用超速离心法。4.根据权利要求2所述的基于黑色素瘤细胞膜的纳米疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤3)中DSPE
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PEG
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Mannose的合成原料包括：将5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜晖，刘腾飞，姚文艳，全金凤，袁乙涵，孙文玉，王雪梅，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：