一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术提供了一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域。包括：根据肿瘤的靶标基因设计合成sgRNA；sgRNA与Cas9蛋白混合、孵育30min，得到CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]脑肿瘤的发病率随着时间的推移而增加，胶质瘤是最常见的原发性恶性肿瘤之一。胶质瘤起源于颅内中性神经胶质细胞，是一种侵袭性和致命的恶性肿瘤。胶质瘤患者的中位生存期约为12
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14个月，5年总生存率接近于零。手术治疗中，高度浸润性和侵袭性的神经胶质瘤细胞模糊了肿瘤和正常脑组织之间的边界，使其难以完全切除。放疗或化疗，如替莫唑胺(TMZ)、顺铂和放射线等，常用于辅助治疗。然而，这些都可能导致强烈的副作用。包括全身性的反应，如恶心、呕吐等消化系统反应；白细胞和血小板减少等骨髓抑制的反应；骨骼疼痛、脱发、器官功能损伤、照射野皮肤损伤，放射性肺炎等其他反应。因此，探索安全有效的治疗策略对于胶质瘤至关重要。肿瘤通常是由于基因突变所导致，因此基因突变在肿瘤的发生和发展中发挥着至关重要的作用，这些突变的基因可以作为有效的治疗靶标。基因治疗被广泛定义为使用载体将核酸引入细胞，达到改变基因表达以预防、停止或逆转病理过程的目的。基因编辑，就是对目标基因及其转录产物进行编辑(定向改造)，实现特定DNA片段的加入、删除，特定DNA碱基的缺失、替换等，以改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能。基因编辑工具已可用于纠正潜在的基因突变。近期，CRISPR
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Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列)在基因治疗中的潜在作用，使其成为肿瘤治疗领域的热点之一。
[0003]CRISPR基因编辑可以直接修饰目标基因，从而改变生物体的生物学特性。现在用于基因组编辑的CRISPR
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Cas9系统有两个组成部分：Cas9蛋白和小向导RNA(sgRNA)。Cas9蛋白可以与双链DNA相互作用并分离2条DNA链。因此，可以形成Cas9蛋白、sgRNA和DNA的三重复合物，sgRNA的前20个核苷酸负责将复合物定位到基因组中的特定位点。一旦复合物形成，Cas9就会产生DNA断裂。迄今为止，CRISPR
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Cas9已应用于肺癌、肝癌、卵巢癌、结直肠癌等的治疗。由于应用的广泛性，将CRISPR
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Cas9系统递送至靶器官或细胞需要安全有效的递送系统。目前的递送载体主要包括病毒和非病毒两大类。尽管病毒载体通过细胞转导能够有效地递送CRISPR
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Cas9系统，但仍可能在宿主体内引起不必要的免疫原性和突变风险，从而限制其临床转化。近年来非病毒载体尤其是纳米载体对CRISPR
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Cas9系统递送的研究取得了一定进展。现有技术中，缺乏有关于使用非病毒载体同时将Cas9蛋白和sgRNA递送的报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种通过Au
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(SG)
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包裹Cas9蛋白、sgRNA的策略，合成CRISPR
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Cas9的非病毒载体的构建方法，本专利技术的目的之二在于提供一种同时递送CRISPR系统Cas9蛋白和sgRNA的pH响应性金团簇纳米系统；本专利技术的目的之三在于提
供所述pH响应性金团簇纳米系统(以下简称为金团簇纳米系统)在靶向治疗肿瘤中的应用，利用Cas9/sgRNA靶向剪切肿瘤突变基因，改变肿瘤的异常生物性状，阻止肿瘤的增殖，以达到清除或控制肿瘤扩散的目的。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统的构建方法，包括以下步骤：
[0007]1)根据肿瘤的靶标基因设计合成sgRNA；
[0008]2)将所述步骤1)得到的sgRNA与Cas9蛋白混合、孵育30min，得到CRISPR
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Cas9 RNP复合物；
[0009]3)将所述步骤2)得到的CRISPR
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Cas9 RNP复合物与Au
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混合、孵育10min，得到介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统。
[0010]优选的，所述步骤2)sgRNA与Cas9蛋白的摩尔比为1:1。
[0011]优选的，所述sgRNA以无RNA酶水溶液的形式与Cas9蛋白混合，所述无RNA酶水溶液中sgRNA的质量浓度为300μg/mL。
[0012]优选的，所述Cas9蛋白以溶液形式与sgRNA混合，所述Cas9蛋白的溶剂为PBS缓冲液，所述溶液中Cas9蛋白的质量浓度为500μg/mL。
[0013]优选的，所述步骤1)肿瘤包括脑胶质瘤；
[0014]所述脑胶质瘤的靶标基因为脑胶质瘤突变基因PLK1，设计合成的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0015]优选的，所述步骤3)CRISPR
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Cas9 RNP复合物与Au
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的质量比为1:20。
[0016]优选的，所述Au
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(SG)
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以溶液形式与CRISPR
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Cas9 RNP复合物混合，所述Au
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的溶剂为PBS缓冲液，所述溶液中Au
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(SG)
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的质量浓度为1mg/mL。
[0017]本专利技术还提供了一种上述技术方案所述的构建方法得到的介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统。
[0018]本专利技术还提供了上述技术方案所述的介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0019]优选的，所述肿瘤包括脑胶质瘤。
[0020]本专利技术的有益效果为：
[0021](1)本专利技术成功构建了CRISPR
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Cas9递送体系，Cas9蛋白可以在细胞内直接发挥作用，本专利技术采取Cas9蛋白和sgRNA同时递送策略，成功构建了具有较好转染效能的CRISPR
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Cas9纳米递送系统，为非病毒载体的研发提供了一种新的尝试。
[0022](2)制备Cas9蛋白和sgRNA复合物的自组装纳米颗粒，选择Cas9蛋白：sgRNA为1:1的转染体系，进行了体内和体外转染的创新性探索。
[0023](3)CRISPR
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Cas9与金团簇组装后形成pH响应性纳米系统存在的pH值靶向特性及多种内吞途径机制，有利于其在肿瘤局部释放纳米颗粒，最大效能发挥体内运输作用。
[0024](4)Cas9/sgRNA可以靶向剪切肿瘤突变基因，改变肿瘤的异常生物性状，阻止肿瘤的增殖，以达到清除或控制肿瘤扩散的目的。
[0025](5)Au
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)根据肿瘤的靶标基因设计合成sgRNA；2)将所述步骤1)得到的sgRNA与Cas9蛋白混合、孵育30min，得到CRISPR
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Cas9 RNP复合物；3)将所述步骤2)得到的CRISPR
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Cas9 RNP复合物与Au
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(SG)
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混合、孵育10min，得到介导CRISPR系统的pH响应性金团簇纳米系统。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)sgRNA与Cas9蛋白的摩尔比为(0.1～2):1。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA以无RNA酶水溶液的形式与Cas9蛋白混合，所述无RNA酶水溶液中sgRNA的质量浓度为300μg/mL。4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述Cas9蛋白以溶液形式与sgRNA混合，所述Cas9蛋白的溶剂为PBS缓冲液，所述溶液中Cas9蛋白的质量浓度为500μg/mL。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)肿瘤包...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔欢欢，吴婕婷，张晓东，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：