用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症的载体制造技术

本发明专利技术涉及一种包含ASAH1开放阅读框的载体，用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症。用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症的载体


[0001]本专利技术涉及一种包含ASAH1开放阅读框的载体，用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症，如与进行性肌阵挛性癫痫相关的脊髓性肌萎缩症或法伯(Farber)病。

技术介绍

[0002]酸性神经酰胺酶缺乏症是包括称为法伯病(FD)的罕见溶酶体贮积症和称为脊髓性肌萎缩症伴进行性肌阵挛性癫痫(SMA
‑
PME)的罕见癫痫病在内的一系列疾病。FD和SMA
‑
PME均是因酸性神经酰胺酶(ASAH1)基因中发生突变引起的，这导致酸性神经酰胺酶活性降低，进而导致神经酰胺积聚以及各种病理表现。FD是一种早发疾病，原因是酸性神经酰胺酶活性低于10％，而残余活性较高则是造成SMA
‑
PME的原因，SMA
‑
PME具有仅限于中枢神经系统(CNS)且始于下运动神经元病的晚发表型。FD始于皮下脂肪肉芽肿、关节痛和声音嘶哑。还观察到，神经和内脏受累分别导致精神运动性迟滞和肝脾肿大。大部分FD患者表现出生长发育障碍，且活不过2岁。包括骨髓在内的受影响的组织中通常存在由泡沫组织细胞和巨噬细胞构成的结节和炎症，这突出了造血系统在疾病中的潜在作用。此外，白细胞似乎主要是在法伯病中发生失调。SMA
‑
PME在婴儿期临床表现为一种下运动神经元病，伴有肌肉无力、行走困难和震颤。癫痫伴肌阵挛发作通常在儿童晚期出现，随着病情演变还可能出现其他临床表现，如认知能力下降、脊柱侧弯和听力丧失。患者一般会在青少年时期因呼吸衰竭而死亡。
[0003]目前还没有治愈酸性神经酰胺酶缺乏症的方法(Yu等人，2018；Orphanet Journal or Rare Diseases；13：121)。因此，目前的治疗策略仅限于症状管理和支持治疗。造血干细胞移植(HSCT)显示出一些有希望的结果，在许多没有影响CNS的FD患者中，其活动性和疼痛均有实质性的改善。然而，在患有经典FD并伴有CNS并发症的患者中进行的HSCT并没有逆转神经表型，并且随着时间的推移，患者病情恶化。还提出了离体基因疗法，其中从患者或供体中分离出造血干细胞(HSC)，使用慢病毒载体通过基因矫正对其进行修饰，然后再移植至有需要的患者中。然而，由于在接受慢病毒载体/酸性神经酰胺酶转导的造血细胞的非人灵长类的大脑中未观察到显著变化，所以这种方法可能无法有效解决ASAH1缺乏症的神经表型(Walia等人，2011；Hum Gene Ther；22，第679
–
687页)。酶替代疗法(ERT)也在开发中，包括向有需要的患者注射重组酸性神经酰胺酶。然而，ERT策略在神经表型方面面临局限性，因为酶穿过血脑屏障的能力很差。
[0004]因此，仍然急需一种针对酸性神经酰胺酶缺乏症例如SMA
‑
PME和法伯病的有效疗法。

技术实现思路

[0005]令人惊喜的是，本专利技术发现了包含ASAH1开放阅读框(ORF)的腺相关(AAV)载体是治疗FD和SMA
‑
PME的高效基因治疗载体。特别地，在此证明，由于本专利技术，CNS和外周改变均得到了矫正。本专利技术是对目前开发的治疗方法的重大改进，因为迄今为止，还没有其他治疗
方法能够矫正这两种改变。
[0006]在第一方面，本专利技术涉及一种重组AAV(rAAV)载体，包含ASAH1ORF。该载体可以用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症的方法中。特别地，所述rAAV载体可以用于治疗选自法伯病(FD)和与进行性肌阵挛性癫痫相关的脊髓肌萎缩症(SMA
‑
PME)的疾病的方法中。在具体的实施方案中，所述AAV载体用于治疗囊性纤维化的方法中。在具体的实施方案中，所述载体是一种能够穿过血脑屏障的AAV载体。具有能穿过血脑屏障的能力的说明性AAV载体包括但不限于包含AAV9衣壳、AAV9P1衣壳、AAVpo1A1衣壳、AAV10衣壳例如AAVrh.10或AAVcy.10衣壳、AAVrh.39衣壳或进化枝F AAVHSC衣壳的载体。在进一步的实施方案中，所述AAV载体包含AAV9衣壳、AAV10衣壳例如AAVrh.10或AAVcy.10衣壳、AAVrh.39衣壳或进化枝F AAVHSC衣壳。在另一个实施方案中，所述AAV载体包含AAV9或AAV10衣壳。在又一个实施方案中，所述AAV载体包含AAV9衣壳。
[0007]对于表达，ASAH1 ORF包含在表达盒中，与调控序列可操作连接。这种调控序列包括但不限于启动子、内含子、增强子和多聚腺苷酸化信号。在具体的实施方案中，所述ASAH1 ORF受遍在性启动子控制。在另一个实施方案中，所述遍在性启动子选自CAG启动子、PGK启动子或β葡萄糖醛酸酶启动子。在进一步的实施方案中，所述ASAH1 ORF受CAG启动子或PGK启动子控制。在具体的实施方案中，所述启动子为CAG启动子。在具体的实施方案中，所述CAG启动子具有SEQ ID NO:9所示的序列，或者所述启动子为所述启动子的具有与SEQ ID NO:9有至少80％同一性特别是与SEQ ID NO:9有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列的功能变体。在具体的实施方案中，所述启动子由与SEQ ID NO:9有至少99％同一性的核酸序列组成，或者由SEQ ID NO:9所示的核酸序列组成。在具体的实施方案中，所述PGK启动子具有SEQ ID NO:3所示的序列，或者所述启动子为所述启动子的具有与SEQ ID NO:3有至少80％同一性特别是与SEQ ID NO:3有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列的功能变体。在具体的实施方案中，所述启动子由与SEQ ID NO:3有至少99％同一性的核酸序列组成，或者由SEQ ID NO:3所示的核酸序列组成。
[0008]在另一个实施方案中，根据包括在表达盒中的启动子，所述盒还可以包含内含子。例如，所述盒还可以包含人β珠蛋白基因的经修饰的内含子2/外显子3序列。在具体的实施方案中，如果所述启动子为PGK启动子，则所述盒还可以包含内含子，如人β珠蛋白基因的经修饰的内含子2/外显子3序列。在具体的实施方案中，所述人β珠蛋白基因的经修饰的内含子2/外显子3序列具有SEQ ID NO:4所示的序列，或者为SEQ ID NO:4所示的序列的功能变体，所述功能变体与SEQ ID NO:4有至少80％的同一性，特别是与SEQ ID NO:4有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在具体的实施方案中，所述包含在盒中的内含子由与SEQ ID NO:4有至少99％同一性的核酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4所示的核酸序列组成。
[0009]在又一个实施方案中，所述表达盒包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号选自ASAH1基因的多聚腺苷酸化信号、来自人β珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信号(HBB pA)、牛生长激素多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号和合成多聚腺苷酸(polyA)，如SEQ ID NO:1的合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含ASAH1开放阅读框(ORF)的重组AAV(rAAV)载体，用于治疗酸性神经酰胺酶缺乏症的方法中。2.根据权利要求1所述的用途的rAAV载体，其中所述酸性神经酰胺酶缺乏症是一种选自法伯病(FD)和与进行性肌阵挛性癫痫相关的脊髓性肌萎缩症(SMA
‑
PME)的疾病。3.根据权利要求1或2所述的用途的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含AAV9、AAV9P1、AAV10、AAVpo1A1、进化枝F AAVHSC、AAVrh.39或AAV
‑
PHP.B衣壳。4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含AAV9衣壳。5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述ASAH1 ORF与遍在性启动子可操作连接。6.根据权利要求5所述的用途的rAAV载体，其中所述遍在性启动子为CAG启动子或PGK启动子。7.根据权利要求6所述的用途的rAAV载体，其中所述启动子为CAG启动子。8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含表达盒，所述表达盒依次包含：
‑
CAG启动子；
‑
ASAH1 ORF；和
‑
多聚腺苷酸化信号序列。9.根据权利要求1至6中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述启动子为PGK启动子。10.根据权利要求1至6和9中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含表达盒，所述表达盒依次包含：
‑
PGK启动子；
‑
人β珠蛋白基因的经修饰的内含子2/外显子3序列；
‑
ASAH1 ORF；和
‑
多聚腺苷酸化信号序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述疾病为FD。12.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的rAAV载体，用于治疗法伯病(FD)的至少一种神经和/或外周表现的方法中。13.根据权利要求12所述的用途的rAAV载体，其中所述方法至少用于治疗FD的血液学表现。14.根据权利要求12或13所述的用途的rAAV载体，其中所述方法用于治疗FD的神经和血液学表现。15.根据权利要求12至14中任一项所述的用途的rAAV载体，其中所述rAAV载体包含AAV9衣壳，所述ASAH1 ORF受CAG启动子控制，所述rAAV载体用于血管内给药。16.一种重组AAV(rAAV)载体，包含：i)衣壳，选自AAV9、AAV9P1、AAV10、进化枝F AAVHSC、AAVrh.39、AAVpo1A1和AAV
‑
PHP.B衣壳；和ii)包含表达盒的基因组，所述表达盒依次包含：
‑
CAG或PGK启动子；
‑
ASAH1 ORF；和
‑
多聚腺苷酸化信号序列。17.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：安娜，
申请(专利权)人：法国国家卫生及研究医学协会埃夫里瓦尔德艾松大学，
类型：发明
国别省市：