重组微生物及其用于生产1,5-戊二胺的方法技术

本公开提供一种重组微生物，其包含表达载体，该表达载体包括编码磷酸吡哆醛基因的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动子序列。本公开还提供使用该微生物生产1,5

【技术实现步骤摘要】
重组微生物及其用于生产1,5
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戊二胺的方法


[0001]本公开涉及一种生产1,5
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戊二胺的微生物，且特别涉及一种经基因重组 的微生物及使用该微生物生产1,5
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戊二胺的方法。

技术介绍

[0002]1,5
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戊二胺是化工产业中用以合成多聚物的重要原料，其生产及制备方 法的改良及效率提升为该领域一直以来的主要课题。
[0003]全细胞催化法(in vitro whole
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cell biotransformation)是现有以 微生物生产1,5
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戊二胺的其中一种方法，其利用完整的生物有机体作为催化 剂而进行化学转化，即，将微生物培养至一定细胞量后，再加入基质进行催 化，进而转化为产物。例如，使用基因重组微生物使其表达赖氨酸脱羧酶 (lysine decarboxylase，CadA)，并通过高密度发酵提升菌量，借以增加赖 氨酸脱羧酶的表达量，进而提升其催化赖氨酸的转化效率以生产戊二胺。然 而，以全细胞催化法生产1,5
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戊二胺时，还必须在反应系统中添加昂贵的磷 酸吡哆醛(pyridoxal 5
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phosphate，PLP)活化赖氨酸脱羧酶(CadA)， 以进一步提升全细胞催化法的效率。
[0004]磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6的活性形式，大肠杆菌细胞中具有两条 磷酸吡哆醛的自生成途径，分别是从头合成法，即利用葡萄糖生产磷酸吡哆 醛，而另一条则称为超级救援途径，即利用维生素B6的前体，如吡哆醛 (pyridoxal，PL)和吡哆醇(pyridoxine，PN)等经催化生成磷酸吡哆醛。
[0005]于先前技术中，已公开于催化过程中添加维生素B6的前体以取代磷酸 吡哆醛的方法，如专利公开号CN109536542A，其公开在反应系统中加入浓度 为0.05至0.5mM的吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等辅酶；另外， 专利公开号CN109097408A则公开在连续酶反应器中加入赖氨酸脱羧酶和维 生素B6辅酶；而专利公开号CN108997141A还公开在赖氨酸和赖氨酸脱羧酶 混合系统中加入吡哆氨、吡哆醇、吡哆醛、磷酸吡哆醛等维生素B6辅酶。 然而，上述直接添加磷酸吡哆醛前体对于生产1,5
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戊二胺的效果不佳，仍需 开发其他提升1,5
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戊二胺产能的全细胞催化法。
[0006]2015年，南京工业大学研究团队(Ma,W.,Cao,W.,Zhang,B.,Chen, K.,Liu,Q.,Li,Y.,&Ouyang,P.(2015).Engineering a pyridoxal5
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phosphate supply for cadaverine production by using Escherichiacoli whole
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cell biocatalysis.Scientific Reports,5(1),1
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10)尝试 利用表达从头合成途径中的基因以提升戊二胺的产量，而韩国Kim等人的团 队(Kim,J.H.,Kim,J.,Kim,H.J.,Sathiyanarayanan,G.,Bhatia, S.K.,Song,H.S.&Yang,Y.H.(2017).Biotransformation of pyridoxal5
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phosphate from pyridoxal by pyridoxal kinase(pdxY)to supportcadaverine production in Escherichia coli.Enzyme and MicrobialTechnology,104,9
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15)则经由表达PdxY并添加PL作为前体的方法，其 获得最高33g/L的戊二胺，生产率为5.5g/L/h，但这些方法的产能及生产 效率并不符合需求，故仍需能进一步提高1,5
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戊二
胺产量的方法。
[0007]有鉴于此，本公开所属
对可有效提升生产1,5
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戊二胺产能的方 法仍有需求，以解决已知技术所存在的问题。

技术实现思路

[0008]为解决上述的问题，本公开提供一种生产1,5
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戊二胺的重组微生物，其 包括至少两个基因，且该至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其 中，该至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛 的酶的基因。于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物所包括的赖 氨酸脱羧酶以及生成磷酸吡哆醛的酶的基因表达被增强。
[0009]于本公开的至少一个具体实施例中，生产1,5
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戊二胺的重组微生物包括 至少两个外源基因，其中，该外源基因为编码赖氨酸脱羧酶(CadA)的基因 和编码生成磷酸吡哆醛(PLP)的酶的基因。
[0010]于本公开的至少一个具体实施例中，该编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因 为pdxH、pdxY、pdK或其任意组合。
[0011]于本公开的至少一个具体实施例中，该重组微生物包含表达载体，其中， 该表达载体包括至少一个编码赖氨酸脱羧酶(CadA)、编码生成磷酸吡哆醛的 PdxH、PdxY或PdxK的核苷酸序列以及控制该核苷酸序列表达的持续型启动 子序列。
[0012]于本公开的至少一个具体实施例中，在该重组微生物所包含的表达载体 中，该编码赖氨酸脱羧酶(CadA)的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：11至 少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：11具有相同活性的序列，该编码PdxH 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：1至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO： 1具有相同活性的序列，该编码PdxY的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：3 至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：3具有相同活性的序列，该编码PdxK 的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：5至少有80％相似度且与SEQ ID NO：5 具有相同活性的序列。
[0013]于本公开的至少一个具体实施例中，该持续型启动子为J系列持续型启 动子的其中一者。于本公开的一些具体实施例中，该J系列持续型启动子包 括J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、 J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、 J23117、J23118及J23119。于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子 为J23100、J23109或J23114。
[0014]于本公开的一些具体实施例中，该持续型启动子为PlacI持续型启动子。
[0015]于本公开的至少一个具体实施例中，该微生物属于大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产1,5
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戊二胺的重组微生物，其包括至少两个基因，且所述至少两个基因的其中至少一者位于表达载体上，其中，所述至少两个基因包括编码赖氨酸脱羧酶的基因以及编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述表达载体包括编码赖氨酸脱羧酶、编码生成磷酸吡哆醛的酶或其组合的核苷酸序列以及控制所述核苷酸序列的表达的持续型启动子序列。3.根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述编码赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列为具有与SEQ ID NO：11至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：11具有相同活性的序列。4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述编码生成磷酸吡哆醛的酶的基因的核苷酸序列为表达PdxH、PdxY、PdxK或其任意组合的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述编码表达PdxH的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：1具有相同活性的序列；所述编码表达PdxY的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：3具有相同活性的序列；或所述编码表达PdxK的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：5至少有80％序列一致性且与SEQ ID NO：5具有相同活性的序列。6.根据权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述持续型启动子为J系列持续型启动子中的其中一者或PlacI持续型启动子。7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述J系列持续型启动子为J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J2310...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉修，吴意珣，薛成凤，陈盈蓉，陈昶邑，柳佑樵，
申请(专利权)人：台湾中国石油化学工业开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：