一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法技术

本发明专利技术涉及外科手术恢复技术领域，尤其为一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法，使用TRIzol试剂(InvitrogenLife Technologies)从临床组织中提取总RNA，使用ArraystarRNAFlashLabeling Kit(Arraystar，Rockville)对样本进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验，然后洗涤芯片，洗涤后的芯片使用AgilentDNAMicroarrayScanner进行扫描，应用AgilentFeatureExtractionV11.0.1.1软件采集芯片探针信号值，使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(foldchange，FC)筛选出所有差异表达的lncRNAs和mRNAs，筛选标准为倍数变化>1.5，P<0.05。本发明专利技术的试剂盒能够快速、准确、定量lncRNANR_003923的表达量水平，有效杜绝了常规荧光定量PCR重复性低、准确性低的缺陷，为青光眼的早期诊断和预后评价提供了重要的检测方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法


[0001]本专利技术涉及外科手术恢复
，具体为一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法。

技术介绍

[0002]青光眼是以视网膜神经节细胞丢失为特征的多因素视神经退行性病变，是血管、遗传、解剖和免疫等多因素的组合，继白内障后第二个导致失明的主要原因，而且这种失明通常是不可逆的，严重影响个人的健康和生活质量，同时还会给患者和社会带来巨大的情感、医疗和经济负担，目前对青光眼的诊断主要依靠病史、形态学和功能学的检查，然而一些患者对早期视觉功能的变化并不敏感，从而导致了诊断的滞后，一旦患者诉视力下降，此时视功能损害将近超过50％，再进行抗青光眼治疗，往往达不到理想效果，目前，青光眼相关的组织或体液生化指标以及检测标准仍处于空白状态，因此，寻找一种特异性高、灵敏度高、个性化的生物标志物对青光眼诊断和检测尤为重要；
[0003]迄今为止，降低眼压仍是青光眼唯一可用的治疗途径，在药物不能充分降眼压的情况下，外科手术可实现这一目的，常用手术包括小梁切除术、深层巩膜切除术、引流装置植入术等，旨在另开旁路将房水从前房排入不同的流出区域，特别是结膜下Tenon
’
s囊和或通过脉络膜上腔作为流出区域以降低眼压，然而，新创建的引流通道失效或植入物阻塞，往往是由于手术切口处炎症反应和无法控制的瘢痕形成造成的，并导致眼压再次增加，国内外专家致力于研究抗瘢痕化药物，其中抗代谢药物、激素、抗血管内皮生长因子、免疫抑制剂等的应用效果取得一致认可，但这些药物对组织选择的特异性低，往往因浓度或作用时间的不灵活对不同个体眼部组织造成损害，如角膜毒性、滤过泡渗漏、低眼压性黄斑病变、滤过泡或引流物相关性眼部感染等，因此寻找具有个性化、特异性高并且更安全的抗瘢痕药物有着非常重要的临床意义；
[0004]长链非编码RNA(long non
‑
coding RNAs，lncRNAs)是长于200个核苷酸的具有很少或没有编码潜能的RNA转录物，具有高度保守性和组织特异性，参与胚胎干细胞的多能性，细胞周期调控，癌症的发展以及其他疾病的发病过程，LncRNA可响应各种刺激的信号，募集相应的复合物以激活或沉默基因表达，不仅参与Tenon
’
s成纤维细胞的表型分化，对青光眼术后切口局部炎症环境、干细胞的维持也存在重要的调节作用，近3年来，我们开展了对青光眼患者以及正常对照组Tenon
’
s囊纤维组织的基因芯片测序，获得了具有差异表达的ncRNA以及mRNA数据库，阐明了lncRNA NR_003923作为ceRNA通过竞争性结合miR
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760/miR
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215
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3p调控IL
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22RA1参与青光眼术后滤过道纤维化发病的机制，并发表SCI期刊论文1篇(Cell Death&Disease)，但要将结果应用于临床，仍需对lncRNA NR_003923的在人体内的检测方法进行深入探讨；
[0005]为避免青光眼患者失明可能，我们需要对青光眼的发病做到早期诊断、早期治疗以及术后预防瘢痕形成，lncRNA NR_003923在青光眼患者中高度表达，并且调节术后瘢痕
化过程，具有成为检测青光眼发病指标(青光眼相关生物标志物)以及监测瘢痕化程度指标的巨大潜力，眼球的解剖特征以及体液
‑
血液流动的动态平衡，使得眼球组织取样这一环节在研究疾病诊疗手段中，显得格外重要，青光眼发病后，患者眼内压升高，刺激眼球各部分细胞内RNA表达改变，改变的RNA以cfRNA形式释放，进入血液循环、体液循环，通过检测cfRNA，早期诊断青光眼以及检测术后瘢痕化程度。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法，以解决
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法，包括以下步骤：
[0008]步骤一：根据lncRNANR_003923序列(NCBI登录号)和18S基因序列(NCBI登录号)分别设计特异性引物，设计规则为：引物长度不超过25bp，TM值50℃
‑
70℃，GC含量40
‑
50％，扩增产物长度110bp，设计序列为：
[0009]lncRNANR_003923上游引物序列：AGATGCAGACGCTCCTGATG
[0010]lncRNANR_003923下游引物序列：AACACAGAAACCAGACGGCA
[0011]内参基因18S上游引物序列：CAGCCACCCGAGATTGAGCA
[0012]内参基因18S下游引物序列：TAGTAGCGACGGGCGGTGTG
[0013]步骤二：差异表达lncRNA检测，使用TRIzol试剂(InvitrogenLifeTechnologies)从临床组织中提取总RNA，使用ArraystarRNAFlashLabelingKit(Arraystar，Rockville)对样本进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验，然后洗涤芯片，洗涤后的芯片使用AgilentDNAMicroarrayScanner进行扫描，应用AgilentFeatureExtractionV11.0.1.1软件采集芯片探针信号值，使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(foldchange，FC)筛选出所有差异表达的lncRNAs和mRNAs，筛选标准为倍数变化>1.5，P<0.05；
[0014]步骤三：对差异表达基因进行基因本体论(Geneontology，GO)分析，描述差异表达基因的功能属性，通过KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)分析，描述差异表达基因的生物学途径，筛选出5条上调lncRNA，分别为：lncRNANR_003923、NR_051983、NR_103749、NR_024358、NR_046113，4条下调lncRNA，分别为：ENST00000553396、TCONS_00004501、NR_028344、NR_024049，通过构建编码基因和非编码基因的共表达网络，根据筛选出的差异表达lncRNAs，应用预测数据库miRcode匹配出与其相互作用的miRNA，应用miRNA靶基因预测数据库(miRDB、miRTarBase和TargetScan)，筛选出相应的mRNA，最终通过分子生物学方法，确定lncRNANR_003923可以调节筋膜组织瘢痕化；
[0015]步骤四：样本收集情况(分组)
[0016]健康对照人群30例，青光眼患者30例，抗青光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于青光眼患者手术后血清lncRNA检测的引物与应用方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：根据lncRNANR_003923序列(NCBI登录号)和18S基因序列(NCBI登录号)分别设计特异性引物，设计规则为：引物长度不超过25bp，TM值50℃
‑
70℃，GC含量40
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50％，扩增产物长度110bp，设计序列为：lncRNANR_003923上游引物序列：AGATGCAGACGCTCCTGATGlncRNANR_003923下游引物序列：AACACAGAAACCAGACGGCA内参基因18S上游引物序列：CAGCCACCCGAGATTGAGCA内参基因18S下游引物序列：TAGTAGCGACGGGCGGTGTG步骤二：差异表达lncRNA检测，使用TRIzol试剂(InvitrogenLifeTechnologies)从临床组织中提取总RNA，使用ArraystarRNAFlashLabelingKit(Arraystar，Rockville)对样本进行标记，使用AgilentSureHyb进行杂交实验，然后洗涤芯片，洗涤后的芯片使用AgilentDNAMicroarrayScanner进行扫描，应用AgilentFeatureExtractionV11.0.1.1软件采集芯片探针信号值，使用AgilentGeneSpringGXv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(foldchange，FC)筛选出所有差异表达的lncRNAs和mRNAs，筛选标准为倍数变化>1.5，P<0.05；步骤三：对差异表达基因进行基因本体论(Geneontology，GO)分析，描述差异表达基因的功能属性，通过KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)分析，描述差异表达基因的生物学途径，筛选出5条上调lncRNA，分别为：lncRNANR_003923、NR_051983、NR_103749、NR_024358、NR_046113，4条下调lncRNA，分别为：ENST00000553396、TCONS_00004501、NR_028344、NR_024049，通过构建编码基因和非编码基因的共表达网络，根据筛选出的差异表达lncRNAs，应用预测数据库miRcode匹配出与其相互作用的miRNA，应用miRNA靶基因预测数据库(miRDB、miRTarBase和TargetScan)，筛选出相应的mRNA，最终通过分子生物学方法，确定lncRNANR_003923可以调节筋膜组织瘢痕化；步骤四：样本收集情况(分组)健康对照人群30例，青光眼患者30例，抗青光眼术后高眼压患者35例，抗青光眼术后眼压控制正常患者30例。收集血液样本2ml。A.健康对照人群a.年龄18
‑
75岁；b.无青光眼等眼科疾病病史c.无慢性疾病史、短期或长期未服用激素治疗。B.青光眼患者入组标准：a.年龄18
‑
75岁；b.眼内压(IOP)升高>21mmHg；c.角镜检查:前房角开放，或周边部虹膜与小梁面夹角减小，房角变...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵阳，段宣初，
申请(专利权)人：爱尔眼科医院集团股份有限公司长沙爱尔眼科医院，
类型：发明
国别省市：