一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测的引物、试剂盒及其制备与应用，本发明专利技术基于位点特异性PCR原理，设计了位点特异性引物，包含rs7438135、rs7668282等位基因在内且距离较远的外侧引物对，以及两条3

【技术实现步骤摘要】
一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测UGT2B7基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于UGT2B7基因rs7438135(
‑
900A>G)和rs7668282(
‑
125T>C)位点的多态性检测。

技术介绍

[0002]癫痫是一种由大脑神经元反复过度放电引起的突发性、短暂性的大脑功能障碍临床综合征。目前癫痫的治疗仍以抗癫痫药物(AEDs)控制发作为主。但在抗癫痫药物的临床治疗过程中出现较大的个体反应差异，患者发作类型相同，相同剂量抗癫痫药治疗，其血药浓度、疗效和不良反应表现相差甚远，有的患者已经达到最大耐受剂量，仍不能控制发作，而有的患者应用常规剂量，就出现严重药物副作用，其主要原因是由于与抗癫痫药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异，遗传药理学和药物基因组学研究表明药物代谢酶的遗传变异是造成个体化药物反应差异较大的主要原因。因此，通过筛选药物作用靶点标志物，选择合适的抗癫痫药物个体化用药方案是癫痫治疗成功的关键。
[0003]尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UGT)是人类重要的一种Ⅱ相生物转化代谢酶系统，进入人体的药物有40％～70％是通过Ⅱ相代谢反应代谢，其中UGT2B7酶是人体中活性最高的UGT酶之一，其底物广泛，且很多位点存在多态性，UGT2B7酶活性的差异主要由单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)造成。近年来，发现UGT2B7基因启动子区两个新SNP位点，分别是rs7438135(
‑
900A>G)位点和rs7668282(
‑
125T>C)位点，rs7438135位点的野生型基因(AA)在抑制启动子活性中发挥一定作用，其基因多态性可能对UGT2B7酶活性产生一定影响，从而影响经酶作用的药物代谢；对于rs7668282位点，关于UGT2B7基因对丙戊酸治疗儿童癫痫疗效影响的研究发现，携带突变型基因(CC/CT)可能增加儿童抗癫痫药的耐药风险。因此UGT2B7 rs7438135和rs7668282多态性对抗癫痫药物的体内代谢及癫痫治疗存在较大影响，但目前还没有检测rs7438135和rs7668282位点SNP的相关产品。
[0004]本领域迫切需要一种可以高效精准地筛选治疗药物的基因检测试剂盒，可全面准确的评估癫痫患者对抗癫痫药的代谢类型，能够早期客观、灵敏和稳定的检测UGT2B7 rs7438135、rs7668282基因突变，以便进行及时、有针对性的抗癫痫治疗，降低医疗成本，节约社会资源。避免药物带给患者的毒副作用及不良反应，增加首次治愈有效性。
[0005]目前用于检测基因多态性的方法很多，如直接测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法、高通量测序等。但存在不同程度的缺陷，直接测序法操作复杂，检测成本高，易造成操作错误和污染；荧光定量PCR法操作简单快速，但是样本易发生交叉反应，假阳性率高；基因芯片法可进行高通量检测，但该方法费用较高，对模板需求量大。操作复杂，耗时长。
[0006]因此有必要建立一种快速检测UGT2B7基因rs7438135、rs7668282位点SNP的方法，为医院及其它医疗机构提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高、可靠性强和成本低的检测方案。

技术实现思路

[0007]目前针对抗癫痫药物个体化用药基因与药物疗效相关性的研究较少，导致抗癫痫药的治疗长期处于停滞阶段。现有检测产品覆盖的药物和相关基因较少，预测不精准，对患者实施个体化给药带来较大的阻碍，市场需要一种高效、便捷的抗癫痫药基因检测试剂盒，基于此，本专利技术应用嵌套式等位基因特异性引物(Nested allele
‑
specific primer，NASP)PCR技术，获得一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒及其检测方法和应用。本专利技术提供了一种不用内切酶，不用测序，节省经费，节省时间，操作简便，且产生的产物的bp数可由设计者控制。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]1.设计筛选了几组特异地用于抗癫痫药物个体化用药基因检测的引物对，所述引物为：
[0010]UGT2B7 rs7438135位点(R1)：
[0011]Outer F：5
’‑
AATCCTCTCAAACTCTAACG
‑3’
；
[0012]Outer R：5
’‑
GCATCTACCATAACAATCAG
‑3’
；
[0013]Inner F：5
’‑
ACTGTGAGGAAGTGAGTCG
‑3’
；
[0014]Inner R：5
’‑
CATTAGGTTAGCTTGTTCTCT
‑3’
[0015]UGT2B7 rs7668282位点(R2)：
[0016]Outer F：5
’‑
GGGTGGAGAGAAAAAGGCTAAGG
‑3’
；
[0017]Outer R：5
’‑
TAAGAGCGGATGAGTTGTTGGGA
‑3’
；
[0018]Inner F：5
’‑
ATGCTCAGACTGTTGATTTAATGAT
‑3’
；
[0019]Inner R：5
’‑
TATAAGTCAAAGTACATACAATG
‑3’
[0020]2.建立了上述引物的扩增方法，包括以下步骤：
[0021]rs7438135位点外侧引物(Outer F/R)：
[0022](1)95℃，预变性5min；95℃，变性15s；61.5℃，退火30s；
[0023](2)72℃，延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min；
[0024]rs7668282位点外侧引物(Outer F/R)：
[0025](1)95℃，预变性5min；95℃，变性15s；63.9℃，退火30s；
[0026](2)72℃，延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min；
[0027]内引物(Inner F/R)：
[0028](1)95℃，预变性5min；95℃，变性15s；63℃，退火30s；
[0029](2)72℃，延伸30s，重复30个循环；72℃延伸10min；
[0030]3.建立了PCR产物结果分析方法：制备1.5％琼脂糖凝胶，取PCR产物4μl上样，在电压100V条件下电泳1小时，电泳结束后，凝胶置于3
×
Safe Green染色液中室温震荡染色30min～1h，将已染色凝胶置于蓝光光源的凝胶成像仪进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测的引物，用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增，其特征在于：所述待测位点包括UGT2B7基因上的rs7438135和rs7668282位点，所述引物对包括rs7438135引物对(R1)、rs7668282引物对(R2)；所述rs7438135引物对包括rs7438135外引物对和rs7438135内引物对，所述rs7438135外引物对包括rs7438135外上游引物Outer F：5
’‑
AATCCTCTCAAACTCTAACG
‑3’
，以及rs7438135外下游引物Outer R：5
’‑
GCATCTACCATAACAATCAG
‑3’
；所述rs7438135内引物对包括rs7438135内上游引物Inner F：5
’‑
ACTGTGAGGAAGTGAGTCG
‑3’
，以及rs7438135内下游引物Inner R：5
’‑
CATTAGGTTAGCTTGTTCTCT
‑3’
；所述rs7668282引物对包括rs7668282外引物对和rs7668282内引物对，所述rs7668282外引物对包括rs7668282外上游引物Outer F：5
’‑
GGGTGGAGAGAAAAAGGCTAAGG
‑3’
，以及rs7668282外下游引物Outer R：5
’‑
TAAGAGCGGATGAGTTGTTGGGA
‑3’
；所述rs7668282内引物对包括rs7668282内上游引物Inner F：5
’‑
ATGCTCAGACTGTTGATTTAATGAT
‑3’
，以及rs7668282内下游引物Inner R：5
’‑
TATAAGTCAAAGTACATACAATG
‑3’
。2.一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的UGT2B7基因rs7438135、rs7668282位点SNP检测引物对R1、R2。3.根据权利要求2所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括R3、R4试剂，所述R3试剂为PCR Taq酶预混液(如：2X M5 HiPer Taq HiFi PCR mix等)，所述R4试剂为无菌蒸馏水。4.一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测方法，其特征在于，包括一下步骤：A、利用权利要求1所述引物对，分别对含rs7438135位点和rs7668282位点的样本进行扩增，得到扩增产物；所述引物对包括rs7438135引物对(R1)、rs7668282引物对(R2)；B、采用琼脂糖凝胶电泳方法进行凝胶成像，观察结果，根据电泳条带出现的位置判断位点的多态性。5.根据权利要求4所述的一种用于抗癫痫药物个体化用药的基因检测方法，其特征在于，所述步骤A包括一下...

【专利技术属性】
技术研发人员：何功浩，尹笋君，王平，余昉，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，
类型：发明
国别省市：