一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合以及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测人类胚胎α

【技术实现步骤摘要】
一种检测人类胚胎
α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合以及方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，特别涉及一种检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合以及方法。

技术介绍

[0002]地中海贫血是一组严重威胁人类健康的常见遗传性人类血红蛋白疾病。血红蛋白疾病包过括珠蛋白合成障碍导致的地中海贫血(如α
‑
和β
‑
地中海贫血)和结构异常导致的异常血红蛋白(如HbC、HbE等病)，它们是世界上最先被鉴定的分子病。早期的一些遗传性贫血病例有许多是来自于地中海地区的移民，该组疾病遂被命名为地中海贫血(thalassemia)，简称地贫。地贫是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病，本病的发生是由于珠蛋白基因发生缺陷，导致肽链合成减少或缺失的遗传性溶血性血红蛋白病，分为α
‑
地中海贫血和β
‑
地中海贫血。临床上又根据临床表现，分为轻型(地中海贫血携带者)、中间型和重型。α
‑
地中海贫血目前在我国发现的缺失突变有17种，最常见的有SEA、4.2kb和3.7kb三种缺失型及CS、WS和QS三种点突变。目前，α
‑
地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此，通过检测，提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。
[0003]因为α
‑
地中海贫血是由于α
‑
珠蛋白基因缺陷或使α
‑
珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血，大部分α
‑
地中海贫血是由于α
‑
基因缺失所致，故可运用基因诊断法对α
‑
基因进行检查。我国对地贫基因诊断始于20世纪80年代，先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析、寡核苷酸(ASO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段，特别是PCR及其相关发展技术，已成为最普遍的基因诊断方法。目前临床上针对单基因遗传病的植入前遗传学诊断技术可分为传统的PCR(聚合酶链反应)检测方法、基于SNP(单核苷酸多态性)芯片的Karyomapping技术和新一代测序
‑‑
目标捕获测序。
[0004]传统PCR虽然灵敏，可以直接判断突变位点的情况，但应用于胚胎植入前遗传学诊断的时候，存在外源性污染、等位基因脱扣(ADO)、扩增失败或者优势扩增等缺点。而由于单基因遗传病的致病基因的位点都是比较罕见的，因此几乎没有致病基因位点是在SNP芯片的探针检测范围中，因而通过SNP芯片无法直接判定致病位点的基因型，而只能依靠其上下游的SNP位点信息，通过家系SNP单体型连锁分析来确定。

技术实现思路

[0005]为了克服了上述技术弊端，本专利技术提供了一种检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合以及方法。一种用于检测α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异性扩增中国人群α
‑
地贫基因的SEA、4.2kb、3.7kb这三种最常见缺失型突变(20对)以及WS、QS、CS三个最常见点突变的引物(1对)，以及特异扩增Alpha缺失区域连锁SNP位点区域(包括α
‑
珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游1
‑
2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(65对)，合计86对引物。本专利技术还提供了检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的方法，使用了上述86对引物组合，并基于高通量测序平台进行检测。
[0006]α
‑
地中海贫血基因突变检测的多重PCR扩增引物依次为：SEA：1～86，具体引物对如下：
[0007]SNP位点信息如下：
[0008]引物条件如下：
[0009]为了实现本专利技术，我们采用了以下技术和方法：
[0010]本专利技术样本的前处理采用了单细胞全基因组扩增技术，可以将微量细胞的基因组进行扩增放大，使其达到能够检测的量。首先将特殊的随机引物跟基因组随机结合、延伸，
这些引物末端带有一段特殊的通用序列，可以使扩增子的尾端互补，从而自身成环，防止DNA过度拷贝，扩增产物无法作为新模板，从而很大程度上防止DNA复制后的的指数性扩增，增加了全基因组扩增的均一性；预扩增的产物用一对引物进行指数扩增，增加扩增产物产量。建库时，将扩增后的全基因组产物进行末端补平添加A接头，再加上测序通用的接头以及测序引物接头等，即为构建好的测序文库，可用于上机测序。上机测序前，采用乳液PCR技术对文库进行油包水扩增，产生测序用模板文库，再通过对阳性模板进行富集以达到上机测序的总量要求，最后基于半导体测序技术进行测序。
[0011]靶向捕获方法：多重PCR捕获测序是一种针对临床及确定疾病基因热点的快速检测模式，可以在保证扩增均一性的前提下，对SNP、InDel等几千甚至上万个位点进行快速靶向线性扩增后，使用测序平台进行大批量样本检测与深度分析的解决方案。专利技术了一种用于检测α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异性扩增中国人群α
‑
地贫基因的SEA、4.2kb、3.7kb这三种最常见缺失型突变(20对)以及WS、QS、CS三个最常见点突变的引物(1对)，以及特异扩增Alpha缺失区域连锁SNP位点区域(包括α
‑
珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游1
‑
2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(65对)，合计86对引物。引物的筛选标准为：不同缺失类型对应的特异性区域扩增结果，同时对应区域的SNP分析可以直接判定胚胎的型别；连锁SNP位点筛选标注：genomAD，east asain MAF(0.2,0.8)，GC含量0.3
‑
0.6，距离连锁分析检测位点上下游1
‑
2M区间。
[0012]高通量测序方法：主要包括使用设计好的多重引物Panel，可识别的特异性条形码和DNA文库；对构建成功的文库进行上机前质检，将质检通过的文库转均一化后，进行模板制备及模板富集，进行模板的扩增，最终阳性模板在Ion Torrent测序平台进行测序实验。
[0013]生物信息分析方法：
[0014]1、下机数据分析方法：将制作好的测序文库体系在Ion Torrent Proton平台中进行高通量测序，测序结束后，采用Torrent_Server_5.0_VM软件对生成的原始测序下机数据进行预处理，去除了下机数据中的接头序列。并用Tmap比对工具将处理过后的测序数据比对到GRCh37(hg19)人类参考基因组上。
[0015]2、地贫基因基因型检测方法：通过Torrent Suite(v5.4.0)分析套件中的“Coverage Analysis和“Var本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括序列为SEA ID NO：1～86的多重PCR引物。2.如权利要求1所述检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于包括由特异性扩增人群α
‑
地贫基因的SEA、4.2kb、3.7kb三种缺失型突变的引物20对，和WS、QS、CS三种点突变的引物1对，以及包括α
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珠蛋白基因HBA1、HBA2特异扩增Alpha缺失区域的连锁SNP位点区域和HBA基因下游1
‑
2Mb范围内紧密连锁的SNP位点的引物65对。3.一种检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，使用了如权利要求1或2任意一项所述检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的引物组合，包括如下步骤：步骤一：提取待测夫妻双方外周血DNA以及胚胎细胞进行全基因组扩增：对外周血进行DNA提取，富集外周血基因组DNA，并且将来自体外培养的第3
‑
6天卵裂期或囊胚期滋养层细胞经过单细胞全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，对得到的DNA进行浓度测定；步骤二：目标片段扩增：将步骤一富集后的DNA与多重PCR扩增试剂和上述引物组合混合，经多重PCR反应，得到扩增后的目的基因DNA片段；步骤三：扩增产物纯化：将多重PCR反应后的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化的多重产物；步骤四：末端补平：在步骤三得到的DNA片段中加入可与黏性末端结合的引物，与末端补平试剂混合并经过孵育，得到平末端的DNA样本；步骤五：接头连接：将步骤四得到的平末端DNA样本与P1接头、adapter接头及接头连接反应试剂混合进行连接反应，得到连接接头的DNA片段；步骤六：磁珠纯化：将步骤五连接接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化的连接接头DNA片段；步骤七：文库扩增与检测：将步骤六纯化的连接接头DNA片段加入文库扩增引物及文库扩增反应试剂进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到目标片段的DNA文库，并对得到的DNA文库进行浓度测定。步骤八：高通量测序：采用高通量测序平台对步骤七得到的DNA文库进行高通量测序；步骤九：生物信息学分析：对胚胎活检细胞的全基因组扩增产物及家系全血DNA样本进行多重捕获测序后进行生物信息学SNP分析，获得夫妇双方及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序数据判断是否遗传了父母亲的致病单体型。4.如权利要求3所述检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，所述步骤二中的多重PCR反应条件为：变性：95℃变性10min，1个循环预扩增：预变性：94℃变性30s，；退火：58℃退火2min、60℃退火3min、62℃退火1min；延伸：72℃延伸1min；退火+延伸5个循环；富集扩增：变性：94℃ 20s退火：66℃退火3min，25个循环；4℃终止。5.如权利要求3所述检测人类胚胎α
‑
地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，所述步
骤五中的P1接头序列为：CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG
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T
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T所述adapter接头是由如下正反两个序列组成的96个Barcode x，Barcode x代表的具体序列如下：A1
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A1
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CGTGTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓红辉，卢晨丽，黎剑平，邢阿宝，
申请(专利权)人：广州奥测生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：