细胞培养基组合及其在培养视网膜类器官中的应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞和类器官培养技术领域，具体涉及细胞培养基组合及其在培养视网膜类器官中的应用

【技术实现步骤摘要】
细胞培养基组合及其在培养视网膜类器官中的应用


[0001]本专利技术涉及细胞和类器官培养
，具体涉及细胞培养基组合及其在培养视网膜类器官中的应用
。

技术介绍

[0002]视网膜类器官是一种利用人来源的胚胎干细胞或者多能诱导干细胞在体外分化而成的细胞球，通过悬浮培养在体外模拟视网膜的生长发育过程，其出现可以加深人们对视网膜疾病的理解和认识
。
特别是对于遗传性视网膜疾病的患者，研究者可以利用患者来源的体细胞等多种细胞重编程为多能诱导干细胞，并分化为视网膜类器官从而构建体外模型，进行发病机制和药物筛选等研究，还可以在体外通过基因编辑的方案修复疾病的突变位点，然后进行细胞替代治疗
。
视网膜类器官的出现一定程度上可以代替动物模型的使用，从而避免适用动物模型中的伦理问题
。
[0003]目前的
3D
视网膜类器官培养方案，大多数都需要使用从动物体内中提取的基质胶或者使用多种外源性小分子诱导，并且还需要在显微镜下对类器官进行挑选解剖等复杂的步骤，这大大增加了类器官培养的难度和异质性，难以获得大量，均一的视网膜类器官
。
所以急需一种简便的无外源性动物蛋白添加的一站式类器官长期培养方法
。
[0004]Zhong
介绍了一种类器官培养方法，将
iPSCs
消化为单个细胞后，进行悬浮培养7天左右，使其形成拟胚体，然后接种于包被有基质胶的培养板上，进行2‑
3W
左右的培养，待其长出来视网膜神经层后，在显微镜下进行分离，然后进行长期的悬浮培养
。
[0005]Kuwahara
同样介绍了一种视网膜类器官的培养方法，将
iPSCs
消化为单个细胞后，将其按
8000
‑
12000
个细胞每孔的密度接种于
V
型低粘附
96
孔板，进行培养，在第6天加人
1.5nM
的人骨成型蛋白
4(BMP4)
，然后每3天换一次液，第
18
天将其转移至低粘附的6孔板中，并在显微镜下将1个类器官分成2‑3个更小的类器官
。
然后加入有
RPE
诱导的小分子进行
RPE
诱导6天，之后换成视网膜神经层诱导的培养基进行诱导，进行长期培养
。
[0006]以上2种经典的视网膜类器官方案都需要在显微镜下对类器官进行分离和筛选，这种操作不仅增加了类器官的异质性，还增加了污染的风险
。
[0007]目前的类器官培养方案，需要添加多种小分子
(
例如骨形态发生蛋白
4)
并且在长期培养的过程中使用动物源性蛋白
(
例如基质胶和胎牛血清
)
，这些小分子和动物源性蛋白的加入不仅不利于后期的临床转化
。
且会干扰药物筛选的结果
。
从而影响类器官更广泛的应用
。
其次目前的类器官培养方案的操作步骤比较复杂，需要在显微镜下剪开和分离，并需要至少将类器官转移至不同的培养皿进行培养，这些步骤增加了类器官培养的异质性，并且增大了其污染和转移丢失的风险
。
再者，现阶段的视网膜类器官培养方案难以产生均一，异质性低的视网膜类器官，这便不能更好的模拟人视网膜的生理状态
。
最后在长期培养过程中，多个类器官在同一个培养皿中会倾向于聚集融合，这样会损伤类器官最外层的结构，影响光感受器的发育，难以构建良好的体外模型
。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供细胞培养基组合及其在培养视网膜类器官中的应用，本专利技术提供了采用无须使用基质胶
、BMP4、
外源性动物蛋白的培养基组合培养视网膜类器官的方法，并基于
PDMS
微孔平台实现视网膜类器官的一站式长期培养
。
[0009]本专利技术提供了视网膜类器官的培养基组合，包括生长培养基和成熟培养基，其中：
[0010]所述生长培养基包括
5vol
％～
20vol
％
KSR、0.2vol
％～
3vol
％
Glutamax、0.2vol
％～
3vol
％化学成分确定的脂质物质
、200
～
800
μ
M 1
‑
硫代甘油和
0.2vol
％～
3vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为体积比1：1的
F12/IMDM
基础培养基；
[0011]所述成熟培养基包括
0.5vol
％～
3vol
％1％ N2 Supplement、1vol
％～
10vol
％人血小板裂解液
、0.1
～1μ
M
视黄酸
、0.1
～
1mM
牛磺酸和
0.1vol
％～
5vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为
DMEM/F12
基础培养基
。
[0012]与其他视网膜类器官的培养基相比，本专利技术提供的培养基组合中，早期培养过程中采用的生长培养基无须使用基质胶，不需要添加
BMP4
，便可以分化为视网膜类器官，同时在后续的长期培养基
(
成熟培养基
)
中使用人血小板裂解液替代胎牛血清，从而实现无动物源性蛋白的类器官培养，且在培养的过程中，不需要在
18
‑
24
天使用
RPE
诱导，而是直接使用成熟培养基诱导便可以产生含有视网膜色素上皮细胞的视网膜类器官，随着培养试验的延长，产生成熟的光感受器
。
基于所述培养基组合间的紧密配合以及
PDMS
微孔平台的应用，在培养的过程中减少人为的操作和干预，简化了培养流程，减少了污染的可能性，进一步获得了更准确的技术效果
。
[0013]在一些具体实施例中，所述生长培养基包括
10vol
％
KSR、1vol
％
Glutamax、1vol
％化学成分确定的脂质物质
、450
μ
M 1
‑
硫代甘油和
1vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为体积比1：1的
F12/IMDM
基础培养基；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
视网膜类器官的培养基组合，其特征在于，包括生长培养基和成熟培养基，其中：所述生长培养基包括
5vol
％～
20vol
％
KSR、0.2vol
％～
3vol
％
Glutamax、0.2vol
％～
3vol
％化学成分确定的脂质物质
、200
～
800
μ
M 1
‑
硫代甘油和
0.2vol
％～
3vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为体积比1：1的
F12/IMDM
基础培养基；所述成熟培养基包括
0.5vol
％～
3vol
％1％
N2 Supplement、1vol
％～
10vol
％人血小板裂解液
、0.1
～1μ
M
视黄酸
、0.1
～
1mM
牛磺酸和
0.1vol
％～
5vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为
DMEM/F12
基础培养基
。2.
根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述生长培养基包括
10vol
％
KSR、1vol
％
Glutamax、1vol
％化学成分确定的脂质物质
、450
μ
M 1
‑
硫代甘油和
1vol
％
Penicillin
‑
Streptomycin
，余量为体积比1：1的
F12/IMDM
基础培养基；所述成...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙玺皓，崔泽凯，梁瑜钦，段春文，陈建苏，
申请(专利权)人：爱尔眼科医院集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：