一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗及制备方法，该疫苗含有灭活的O109、O36和O78三种血清型大肠埃希氏菌和佐剂，三种大肠埃希氏菌分别经通气培养后收获菌液再经灭活，再混合后而制成灭活疫苗，O109血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCCM20211519，O36血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCCM20211520，O78血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCCM20211518。本发明专利技术对血清O109、O36、O78血清型禽致病性大肠杆菌强毒菌株攻毒的免疫保护率均达到90％以上。本发明专利技术对O109、O36、O78血清型禽致病性大肠杆菌菌株感染具有良好的免疫保护效果。疫保护效果。

【技术实现步骤摘要】
一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]禽致病性大肠杆菌病是由某些特定血清型的致病性大肠杆菌(pathogenicEscherichia coli)通过多种途径感染不同日龄、品种的鸡，引发不同日龄、品种鸡的急性败血症、肝周炎等多种症状，尤其对雏鸡具有很高的感染率和死亡率，常常继发多种病毒性、呼吸道性疾病等，是影响养鸡业发展的主要细菌性疾病之一。
[0003]禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)血清型繁多，国内外研究表明了APEC的致病性血清多数以O1、O2、O35、O36、O78型血清群是最为主要的致病血清型，不同的区域流行的血清型不同，其致病性也存在差异。
[0004]此外，APEC亦是通过其携带质粒和遗传物质交换而传播耐药基因的主要来源。多年的生产实践表明，通过消除易感因素或通过药物防控禽大肠杆菌病效果甚微，且随着耐药菌株不断产生及药物残留问题的增加，禽产品质量安全愈来愈受到人们的重视。因此，利用非抗生素方法防控APEC将是未来发展的必然趋势，其中接种疫苗是有效防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要途径。
[0005]基因工程类疫苗由于其生产成本较高、生物安全难以保证，在实际生产中不如灭活疫苗应用广泛，目前市面上所流通的大肠杆菌灭活疫苗多为蜂胶佐剂疫苗，且多是针对O78型单一血清型进行保护，但大肠杆菌疫苗对不同血清型的交叉保护能力较差，故应针对优势流行血清型制备多价疫苗以提供保护。已有产品采用蜂胶佐剂制苗虽然具有较好的安全性，但蜂胶佐剂制苗难以产生较高的保护力，因此应该寻找对家禽产生较小副作用且制苗后具有较高保护力的佐剂。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供O36、O78、O109血清型禽致病性大肠杆菌，致病性较强，灭活后能保留较强免疫原性，适合用于制备治疗禽大肠杆菌病的药物。本专利技术另一个目的是提供一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗，能够诱导产生较高的抗体水平，并且能够保护当前流行的大肠杆菌O78、O36和O109等血清型强毒株的感染。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一株禽致病性大肠杆菌菌株，为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC
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106，已于2021年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，其保藏号为CCTCC M 20211519可用于预防O109血清型禽致病性大肠杆菌感染，一次免疫后，保护效果为 90％以上。
[0009]本专利技术所述禽致病性大肠杆菌菌株在制备疫苗中的应用。
[0010]本专利技术提供所述保藏号为CCTCC M 20211519的禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
[0011]本专利技术还提供，该疫苗含有灭活的O109、O36和O78三种血清型大肠埃希氏菌，三种大肠埃希氏菌分别经通气培养后收获菌液再经灭活，再混合后而制成灭活疫苗。
[0012]本专利技术提供的疫苗中，O36血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCC M20211520，O78血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCC M 20211518，均已于 2021年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
[0013]可用于预防O109、O78、O36血清型禽致病性大肠杆菌感染，一次免疫后，保护效果为80％以上。
[0014]本专利技术的所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗中，灭活的各大肠埃希氏菌菌株的抗原含量大于等于1.2
×
10
10
CFU/ml。
[0015]本专利技术所述的疫苗中，还包含佐剂。
[0016]本专利技术所述的疫苗中，所述佐剂为铝胶佐剂或医用白油佐剂。
[0017]本专利技术所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗的方法，其包括如下步骤：
[0018]1)制备禽致病性大肠杆菌菌株灭活抗原
[0019]取所述禽致病性大肠杆菌菌株接种于LB培养基中培养，并分别进行一级和二级种子繁殖；然后转接培养，并进行灭活处理；
[0020]2)配制疫苗
[0021]将灭活处理的菌液稀释或浓缩，使灭活前活菌数大于等于1.2
×
10
10
CFU/ml；取灭活菌液与佐剂按3：1体积比进行混匀，搅拌并乳化处理，得所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗。
[0022]具体地，步骤1)中所述转接培养的条件为二级种子液按照体积比1：100转接至摇瓶中，37℃震荡摇床180r/min，发酵至三小时后，每0.5h测定一次OD
600
，当发酵液OD
600
测定为1.3时，停止发酵。通过高速冷冻离心机4℃，8000r/min 离心15min，弃上清，采用原体积发酵液的1/20体积的生理盐水重悬菌泥，充分震荡混匀后取100μl菌液倍比稀释后通过活菌计数确定各菌液的终浓度；
[0023]所述灭活处理采用所述菌液加入体积比0.5％甲醛溶液，37℃摇床100r/min 灭活48h。
[0024]本专利技术以EC
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580、EC
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106、EC
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54菌株为疫苗制备用菌株，医用白油或者铝胶作为佐剂，通过不同批次的动物实验确定疫苗的安全性、免疫剂量、疫苗抗原含量、免疫保护期以达到最佳免疫保护效果。并通过免疫保护实验中鸡群的死亡率、发病率以及通过酶联免疫吸附试验对鸡群体内的抗体水平评估数据，确定该疫苗的免疫效果优于同类产品。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026]1.本疫苗候选菌株来源于多个省市的病料的分离株并通过血清学分型、毒力基因检出分析以及雏鸡致病性试验共同确定的；
[0027]2.本疫苗的菌种是通过甲醛溶液灭活的；
[0028]3.本疫苗的佐剂可采用医用白油佐剂或铝胶佐剂，二者制苗后均可产生对鸡群很好的保护作用，且不影响鸡群的生长性能。
[0029]4.本疫苗对于蛋鸡以及肉鸡均具有保护作用。
[0030]综上所述，禽大肠杆菌O9、O78、O109各单价苗对于同型菌株的感染能够做到较好的保护效果，但仅针对相同的单一血清型禽大肠杆菌进行保护，交叉保护效果不理想。因此，针对目前主要流行的O78、O9和O109血清型，本专利技术研发了禽大肠杆菌病三价灭活疫苗以达到能够同时对这三种血清的大肠杆菌的感染进行保护并且选用黏度较低的白油佐剂或者铝胶佐剂疫苗免疫后抗体产生时间、维持水平均优于蜂胶佐剂。
[0031]综上所述，本专利技术所研发的禽大肠杆菌三价灭活疫苗，具有良好的免疫原性，免疫动物后结果表明对鸡只安全，能够诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽大肠杆菌病三价灭活疫苗，该疫苗还含有灭活的O109、O36和O78三种血清型大肠埃希氏菌，三种大肠埃希氏菌分别经通气培养后收获菌液再经灭活，再混合后而制成灭活疫苗，O109血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCC M 20211519，O36血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCC M 20211520，O78血清型大肠埃希氏菌，其保藏号为CCTCC M 20211518。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述禽致病性大肠杆菌灭活疫苗中，灭活的各大肠埃希氏菌菌株的抗原含量大于等于1.2
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CFU/ml。3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，还包含佐剂。4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝胶佐剂或医用白油佐剂。5.制备权利要求1
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4任意一项所述禽致病性大肠杆菌三价灭活疫苗的方法，其特征在于，其包括如下步骤：1)制备禽致病性大肠杆菌菌株灭活抗原取所述禽致病性大肠杆菌菌株接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王湘如，贾超莹，付霁阳，李祖刚，胡子喆，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：