激活调节性T细胞的方法技术

本文提供了刺激或增加T

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】激活调节性T细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月26日提交的美国临时专利申请序列号62/981,944和于2020年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/975,141的优先权，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。


[0003]本公开涉及生物技术和免疫学领域，并且更具体地，涉及刺激或增加T
reg
细胞的增殖的方法。

技术介绍

[0004]组织因子(TF)是263个氨基酸的整体膜糖蛋白，分子量约为46kDa，是外在血液凝固路径的触发蛋白，是体内凝血的主要引发剂。通常不与循环血液接触的组织因子在暴露于循环凝血丝氨酸蛋白酶因子后引发凝血级联反应。血管损伤暴露了表达组织因子的内皮下细胞，从而引起与预先存在的血浆因子VIIa(FVIIa)形成钙依赖性高亲和力复合物。丝氨酸蛋白酶FVIIa结合到组织因子促进了FX快速裂解为FXa和FIX快速裂解为FIXa。所得FXa和活性膜表面的蛋白水解活性于是无法有效地将少量凝血酶原转化为凝血酶。FXa产生的凝血酶引发血小板活化，并且将微量的原辅因子：因子V(FV)和因子VIII(FVIII)活化成为活性辅因子：因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)。FIXa与FVIIIa在血小板表面上复合，形成内在液化酶(tenase)复合物，从而引起FXa快速产生。FXa与FVa复合，在活化的血小板表面上形成凝血酶原酶复合物，其引起凝血酶原快速裂解为凝血酶。
[0005]除了组织因子
‑
FVIIa复合物外，最近的研究表明，组织因子
‑
FVIIa
‑
FXa复合物也能够活化FVIII，从而在初始阶段提供额外水平的FVIIIa。外在路径首要之处在于通过有限量的凝血酶的活化来引发凝血，而内在路径通过显著扩增初始信号来维持凝血。
[0006]细胞表面表达的许多组织因子被“加密”，为了完全参与凝血，必须被“解密”。目前，细胞表面组织因子“解密”的机制尚不清楚，但是，阴离子磷脂的暴露在此过程中起着重要作用。健康细胞会主动将阴离子磷脂(例如磷脂酰丝氨酸(PS))隔离到质膜的内部小叶上。在细胞损伤、活化或胞质Ca
2+
水平增加之后，这种双层不对称性消失，导致外部小叶上PS暴露增加，从而增加了细胞表面组织因子
‑
FVIIa复合物的比活性。已知PS暴露会降低组织因子
‑
FVIIa复合物活化FIX和FX的表观Km，但其它机制可能包含组织因子或组织因子
‑
FVIIa的构象重排以及随后的底物结合位点暴露。
[0007]过继免疫疗法或细胞疗法需要体内培养从受试者获得的免疫细胞(和任选地对免疫细胞进行基因操作以表达嵌合抗原受体或T细胞受体)，之后给予回所述受试者体内。需要足够数目的免疫细胞以便在受试者中提供治疗作用。在许多实例中，需要持续三周或三周以上培养从受试者获得的免疫细胞才可获得治疗有效数目的免疫细胞。另外，许多体外培养从受试者获得的免疫细胞的方法需要一层饲养细胞，所述方法需要随后纯化或分离免疫细胞，之后再给予回受试者体内。

技术实现思路

[0008]在接受T
reg
细胞的患者中已示出出色的安全特性(Esensten等人,《过敏与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)》142(6):1710
‑
1718,2018)。早期临床研究显示，在使用Treg细胞预防和治疗急性和慢性移植物抗宿主疾病(Brunstein等人,《血液(Blood)》117(3):1061
‑
1070,2011；Di Ianni等人,《血液》117(14):3921
‑
3928,2011；Martelli等人,《血液》124(4):638
‑
644,2014；Theil等人,《细胞疗法(Cytotherapy)》17(4):473
‑
486,2015；Brunstein等人,《血液》127(8):1044
‑
1051,2016)、自身免疫和神经退行性疾病(Thonhoff等人,《神经病学：神经免疫学和神经炎症(Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm)》5(4):e465,2018；Dall'Era等人,《关节炎和风湿病(Arthritis Rheumatol)》71(3):431
‑
440,2019)方面取得了令人鼓舞的结果。
[0009]要使用基于T细胞的过继性疗法，包含Treg细胞，GMP制造环境需要离体细胞刺激步骤。抗CD3/抗CD28抗体包被的磁性珠粒(免疫磁珠(Dynabead)，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))最常与IL
‑
2组合用于细胞刺激和扩增(Highfill等人,《最新血液恶性肿瘤报告(Curr Hematol Malig Rep)》14(4):269
‑
277,2019)。如果使用此方法，那么必须开发方法以确保T细胞在培养采集时和输注到患者体内之前“无珠粒”。在此研究中，描述了一种采用2t2和3t15*
‑
28s分别有效替代IL
‑
2和抗CD3/抗CD28包被的磁珠的方法，用于T细胞刺激和扩增，而不使用雷帕霉素(rapamycin)。3t15*
‑
28s是可溶性融合蛋白复合物，其可以通过简单的洗涤步骤轻松从培养物中去除，消除了对去除珠粒的需要，从而节省时间和处理成本，并且提高细胞回收率。另外，还证明，在细胞刺激和扩增之前或之后，在Treg细胞的分离或纯化中包含使用抗CD39抗体的分离步骤可以富集CD4
+
CD25
hi CD127
lo
和CD39
hi Treg，使Treg细胞的纯度、一致性和效应功能增加。
[0010]人类的老化与全身性炎症升高相关(Ferrucci等人,《血液》105(6):2294
‑
2299,2005；Dinarello,《美国临床营养学杂志(Am J Clin Nutr)》83(2):447S
‑
455S,2006)。将炎症与老化连接起来的过程被称为炎性老化(Franceschi等人,《纽约科学院年鉴(Ann N Y Acad Sci)》908:244
‑
254,2000)。老化过程与影响免疫系统的重大变化有关，并导致各种与老化相关的病理学。
[0011]免疫系统的功能是检测和应对组织的损伤或病原性微生物的入侵。抵抗感染的第一道防线的先天性免疫细胞表达不同的种系编码模式识别受体(PRR)，所述PRR识别微生物特有的保守病原体相关分子模式(PAMP)(Janeway,冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harb Symp Quant Biol)54Pt 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:2至少80％相同的序列。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。20.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。21.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。22.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。24.根据权利要求1到23所述的方法，其中所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少80％相同的序列。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少90％相同的序列。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:3的序列。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:4至少80％相同的序列。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:4至少90％相同的序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:4的序列。31.根据权利要求1到30中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述单链嵌合多肽。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述单链嵌合多肽。33.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约1:1到约6:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约3:1到约5:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。36.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。41.根据权利要求36到40中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。42.根据权利要求36到40中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。43.根据权利要求36到42中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。44.根据权利要求36到42中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。45.根据权利要求36到44中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合
结构域包括SEQ ID NO:5的序列。49.根据权利要求36到48中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。53.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。57.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。58.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。59.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
60.根据权利要求36到59中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。61.根据权利要求36到60所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽不引发血液凝固。62.根据权利要求36所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。64.根据权利要求63所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。65.根据权利要求64所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。67.根据权利要求66所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。68.根据权利要求36到67中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述另外的单链嵌合多肽。69.根据权利要求68所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述另外的单链嵌合多肽。70.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。71.根据权利要求70所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。74.根据权利要求73所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。75.根据权利要求70到74中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。76.根据权利要求70到74中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。77.根据权利要求70到76中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。78.根据权利要求70到76中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。79.根据权利要求70到78中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。80.根据权利要求79所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。81.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。83.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。87.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。88.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。89.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。90.根据权利要求70到89中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。91.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同的序列。92.根据权利要求91所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少90％相同的序列。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:102的序列。94.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同的序列。95.根据权利要求94所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少90％相同的序列。96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:104的序列。97.根据权利要求70到96中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。98.根据权利要求97所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。100.根据权利要求99所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。101.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同的序列。102.根据权利要求101所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少90％相同的序列。103.根据权利要求102所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:106的序列。104.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少80％相同的序列。105.根据权利要求104所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少
90％相同的序列。106.根据权利要求105所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:108的序列。107.根据权利要求70到106所述的方法，其中所述多链嵌合多肽不引发血液凝固。108.根据权利要求70到107中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述多链嵌合多肽。109.根据权利要求108所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述多链嵌合多肽。110.根据权利要求1到109中任一项所述的方法，其中所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。111.根据权利要求110所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素(rapamycin)。112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。113.根据权利要求112所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。114.根据权利要求1到109中任一项所述的方法，其中所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。115.根据权利要求1到114中任一项所述的方法，其进一步包括：在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。116.根据权利要求115所述的方法，其中进行所述单链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM。117.根据权利要求116所述的方法，其中进行所述单链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约50nM到约150nM。118.根据权利要求1到117中任一项所述的方法，其进一步包括：在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。119.根据权利要求1到118中任一项所述的方法，其中所述时间段为约7天到约56天。120.根据权利要求119所述的方法，其中所述时间段为约15天到约25天。121.根据权利要求1到120中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述T
reg
细胞的步骤。122.根据权利要求1到120中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述T
reg
细胞的步骤。123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。124.根据权利要求1到123中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是从外周血或脐带血中分离的自体T
reg
细胞、单倍同一性T
reg
细胞或同种异体T
reg
细胞。125.根据权利要求1到124中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
细胞。
126.根据权利要求1到124中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是CD4
+
CD25
+
CD127
dim
细胞。127.根据权利要求1到126中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞包括嵌合抗原受体。128.一种T
reg
细胞群，其通过根据权利要求1到127中任一项所述的方法产生。129.一种组合物，其包括根据权利要求128所述的T
reg
细胞群以及药学上可接受的载体。130.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求129所述的组合物。131.根据权利要求130所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。132.根据权利要求131所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。133.根据权利要求131所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病(Crohn's disease)、多发性硬化症、格林巴利综合征(Guillain
‑
Barre syndrome)、牛皮癣、格雷夫氏病(Grave's disease)、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。134.一种试剂盒，其包括：(i)CD3/CD28结合剂；(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL
‑
2的受体结合；以及(iii)mTOR抑制剂。135.根据权利要求134所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。136.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。137.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单
链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。138.根据权利要求137所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。139.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。140.根据权利要求139所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。141.一种刺激或增加T
reg
细胞的增殖的方法，其中所述方法包括：在一定时间段内在液体培养基中培养T
reg
细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：IL
‑
2受体活化剂；以及单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。142.根据权利要求141所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。143.根据权利要求142所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。144.根据权利要求143所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。145.根据权利要求144所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。146.根据权利要求141到145中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所
述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。147.根据权利要求141到145中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。148.根据权利要求141到147中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。149.根据权利要求141到147中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。150.根据权利要求141到149中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。151.根据权利要求150所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。152.根据权利要求151所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。153.根据权利要求152所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。154.根据权利要求141到153中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。155.根据权利要求154所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。156.根据权利要求155所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。157.根据权利要求156所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。158.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。159.根据权利要求158所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。160.根据权利要求159所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。161.根据权利要求160所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。162.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。163.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以
及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。164.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。165.根据权利要求141到164中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。166.根据权利要求141到165所述的方法，其中所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。167.根据权利要求141所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。168.根据权利要求167所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。169.根据权利要求168所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。170.根据权利要求169所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。171.根据权利要求170所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。172.根据权利要求171所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。173.根据权利要求141到172中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述单链嵌合多肽。174.根据权利要求173所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述单链嵌合多肽。175.根据权利要求141到174中任一项所述的方法，其中所述IL
‑
2受体活化剂是可溶性IL
‑
2。176.根据权利要求175所述的方法，其中所述可溶性IL
‑
2是人可溶性IL
‑
2。177.根据权利要求176所述的方法，其中所述人可溶性IL
‑
2包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列。178.根据权利要求177所述的方法，其中所述人可溶性IL
‑
2包括与SEQ ID NO:1至少90％相同的序列。179.根据权利要求178所述的方法，其中所述人可溶性IL
‑
2包括SEQ ID NO:1的序列。180.根据权利要求176到179所述的方法，其中所述液体培养基包括约100IU/mL到约800IU/mL的所述人可溶性IL
‑
2。
181.根据权利要求180所述的方法，其中所述液体培养基包括约400IU/mL到约600IU/mL的所述人可溶性IL
‑
2。182.根据权利要求141到181中任一项所述的方法，其中所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。183.根据权利要求182所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。184.根据权利要求182或183所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。185.根据权利要求184所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。186.根据权利要求141到181中任一项所述的方法，其中所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。187.根据权利要求141到186中任一项所述的方法，其进一步包括：在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述IL
‑
2受体活化剂。188.根据权利要求187所述的方法，其中进行所述IL
‑
2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL
‑
2受体活化剂的浓度为约10nM到约1000nM。189.根据权利要求188所述的方法，其中进行所述IL
‑
2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL
‑
2受体活化剂的浓度为约50nM到约150nM。190.根据权利要求141到189中任一项所述的方法，其进一步包括在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。191.根据权利要求141到190中任一项所述的方法，其中所述时间段为约7天到约56天。192.根据权利要求191所述的方法，其中所述权利要求的时间段为约15天到约25天。193.根据权利要求141到192中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述T
reg
细胞的步骤。194.根据权利要求141到192中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。195.根据权利要求193或194所述的方法，其中所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。196.根据权利要求141到195中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是从外周血或脐带血中分离的自体T
reg
细胞、单倍同一性T
reg
细胞或同种异体T
reg
细胞。197.根据权利要求141到196中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
细胞。198.根据权利要求141到196中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞是CD4
+
CD25
+
CD127
dim
细胞。199.根据权利要求141到198中任一项所述的方法，其中所述T
reg
细胞包括嵌合抗原受体。200.一种T
reg
细胞群，其通过根据权利要求141到199中任一项所述的方法产生。201.一种组合物，其包括根据权利要求200所述的T
reg
细胞群以及药学上可接受的载
体。202.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求201所述的组合物。203.根据权利要求202所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。204.根据权利要求203所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。205.根据权利要求203所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。206.一种试剂盒，其包括：(i)白细胞介素
‑
2受体活化剂；(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合；以及(iii)mTOR抑制剂。207.根据权利要求206所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。208.一种刺激或增加T
reg
细胞的增殖的方法，其中所述方法包括：在一定时间段内在液体培养基中培养T
reg
细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：CD3/CD28结合剂；以及多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：HCW生物科技公司，
类型：发明
国别省市：