连续回收蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种从流体中连续回收蛋白质的方法，包括使流体中的蛋白质沉淀并将沉淀的蛋白从流体中分离出来。本发明专利技术还提供了一种斜板式沉降器，其可用于这种连续的蛋白质回收。其可用于这种连续的蛋白质回收。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】连续回收蛋白质的方法


[0001]本专利技术涉及一种从流体中连续回收蛋白质的方法，包括在流体中沉淀蛋白质并将沉淀的蛋白质从流体中分离出来。本专利技术还提供了一种可用于这种连续蛋白质回收的斜板式沉降器。

技术介绍

[0002]传统来说，生物制药过程已经并且仍然以(半)分批方式进行。在分批过程中，所有单元操作都是按顺序执行的，这意味着当前一个操作完成时，该过程会进入下一步。这一行动过程需要在各个步骤之间将产品收集在储罐中。因此，分批生产过程的特点是停留时间长，在此期间产品的状态有时可能不理想。对于酶或凝血因子等自身不稳定的产品，较长的储存时间和停留时间尤为关键。
[0003]因此，针对凝血因子和酶开发了第一个由连续上游组成的混合工艺(例如，灌注细胞培养，包含分批下游工艺)。随着生产细胞系和滴度的进步，瓶颈从上游转移到下游过程。因此，对生物制药连续过程的关注在过去几年中大大增加。据报道，集成的连续过程具有一系列好处，例如(i)提高产品质量，(ii)增加过程控制和过程透明，(iii)降低商品成本(COG)，(iv)更小的设备尺寸，从而减少占地面积(即设施规模)和设备成本，(v)提高产率和(vi)更高的灵活性。值得注意的是，连续过程的全部潜力只能在完全集成、连续或端到端的连续过程中发挥。
[0004]蛋白质沉淀可用于生物制药生产过程的下游过程。它通常用于捕获目标蛋白，从而实现显著的体积减少，即目标蛋白的浓缩。沉淀可以线性放大，不需要复杂的设备，而且可以在非变性条件下进行。此外，沉淀原则上可以连续操作，因为唯一的要求是将沉淀剂连续添加到工艺流中并进行有效混合，而且根据沉淀动力学，需要保证足够的时间以完成沉淀。
[0005]尽管具有公认的潜力，但重组蛋白的连续沉淀过程的例子很少见(参见参考文献1至3)。在一个示例中，一个两阶段沉淀工艺使用CaCl2去除DNA，随后经冷乙醇沉淀以捕获产物(mAb)，结果显示产率>90％并显著减少杂质(参见参考文献4)。此外，使用聚乙二醇(PEG)连续沉淀各种抗体，随后基于切向流过滤回收沉淀也有报道(参见参考文献5)。一个非常相似的工艺被开发用于连续抗体沉淀，包括集成的连续沉淀分离和洗涤(参见参考文献6)。最后，展示了使用不同沉淀方法连续沉淀杂质，尽管本研究的重点是展示所谓的盘绕流逆变反应器(CFIR)的广泛的应用可能，而不是沉淀工艺的开发(参见参考文献7)。然而，总体而言，明显缺乏连续沉淀过程的例子。
[0006]在本专利技术中，待回收的蛋白质(例如凝血因子)可以被捕获，即沉淀，例如，使用磷酸钙沉淀。至少由于这个特点，它不同于参考文献4中的过程，参考文献4中一种主要杂质(DNA)是使用钙离子沉淀的。在全部参考文献1～7中，产物是使用PEG或冷乙醇沉淀的单克隆抗体。单克隆抗体通常以g/L范围内的滴度生产。该滴度比重组凝血因子的生产滴度高几个数量级。本专利技术的优势之一是它可以捕获以非常低浓度存在的复杂产物。
[0007]连续沉淀过程的主要瓶颈是固液分离步骤。在分批操作中，固液分离可以很容易地通过终端过滤或离心进行。过去，对离心的需求和相关挑战在制造规模上阻碍了沉淀的应用(参见参考文献8)。当连续操作时，离心尤其变得更具挑战性。大多数半连续式离心机在以固定间隔排放固体的情况下运行，会产生不连续的输出。此外，据报道，离心后难以有效地重新溶解沉淀物，这些问题通过使用跨膜流动过滤进行分离得以解决(参见参考文献5)。然而，并非所有沉淀物都适合通过跨膜流动过滤进行分离。此外，在跨膜流动过滤模块中收集的沉淀物的连续分离和溶解也产生周期性输出，类似于离心。
[0008]综上所述，对于蛋白质的连续回收方法的改进，特别是包括蛋白质沉淀和连续固液分离(即连续沉淀
‑
液体分离)的连续蛋白质回收方法的需求很大。

技术实现思路

[0009]本专利技术满足了上述需要而且解决了本领域的上述问题：
[0010]专利技术人惊奇地发现，通过沉淀蛋白质并将沉淀的蛋白质从流体中分离，可以从流体中连续回收蛋白质。当磷酸钙用于蛋白质沉淀时，蛋白质回收允许回收相对较大的蛋白质(例如凝血因子)即使在非常低的浓度下。通过在沉淀前调节包含蛋白质的流体的pH值，以及通过使用限定浓度范围内的磷酸钙，可以进一步提高蛋白质回收的效率。
[0011]此外，专利技术人惊奇地发现，当使用板式沉降器分离蛋白质沉淀并且当该板式沉降器连接到专门设计的底部时，从流体中连续回收蛋白质的方法特别有效。该特别设计的底部包括至少一个用于将包含沉淀蛋白质的流体供应至板式沉降器的入口通道，以及至少一个用于收集沉降的沉淀蛋白质的收集通道，其中入口通道和收集通道彼此流体分离。入口通道和收集通道之间的流体分离(即没有直接的流体连通)促进了对底部流体流动行为的更好控制。具体地，降低或者甚至避免了由供应的流体和下沉的蛋白质沉淀物和/或下沉的分离流体(例如，包含待分离的沉淀蛋白质)的混合物引起的湍流。此外，较少或没有分离的蛋白质沉淀混入新供应的流体(即沉淀悬浮液)中。因此，根据本专利技术的底部结构提高了分离过程的效率。
[0012]此外，专利技术人发现，当底部进一步包括至少一个与所有入口通道流体分离的洗涤流体供应通道时，这是特别有利的，所述洗涤流体供应通道用于将洗涤流体供应到板式沉降器或底部的收集通道，以便于沉淀的沉淀蛋白质通过收集通道排出(即，洗脱)。这提高了分离过程的效率。例如，当沉淀的蛋白质不能有效排出时，可能是因为有粘附到表面的趋势，例如底部的表面等，供应洗涤液会有助于收集沉淀的蛋白质并通过底部的收集通道将其“冲洗”干净。洗涤液还可以促进沉淀的蛋白质与供应的流体(剩余部分)的分离。这可能很重要，因为流动相可能仍然具有很高的价值(例如，它可能仍然包含目标蛋白质)，而且/或者因为它可能包含人们想要去除的杂质。调整洗涤液的组成和密度进一步提高了分离过程的效率。
[0013]专利技术人已经发现类似于上述的板式沉降器，其可以连接到类似于上述的底部，也可以用于连续分离细胞。因此，在一个实施方案中，根据本专利技术从流体中连续回收蛋白质的方法包括在流体(例如，细胞培养基)中培养产生蛋白质的细胞，以便细胞释放蛋白质到流体中，然后使用用于细胞分离的板式沉降器从流体中分离细胞。
[0014]最后，本专利技术人出乎意料地发现，当从剩余流体中分离出蛋白质沉淀后，使用EDTA
重新溶解沉淀蛋白质时，本专利技术的蛋白质回收特别有效。在本专利技术之前，EDTA已被排除作为重新溶解的候选物质，因为它对钙的高络合能力被认为对蛋白质(例如，因子VIII)活性有害。
[0015]在上述从流体中连续回收蛋白质的方法中，当板式沉降器包括至少一个用于使沉淀蛋白质沉降的相对较长的沉降通道时，是特别有利的。因此，本专利技术还提供了一种板式沉降器，包括长度为20cm～150cm、优选40cm～60cm、最优选约50cm的沉降通道。
[0016]综上所述，本专利技术通过提供下述优选实施方案，提供了一种从流体中连续回收蛋白质的改进方法，以及一种改进的板式沉降器：
[0017]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从流体中连续回收蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤；和将沉淀的蛋白质从流体中分离出来的蛋白质分离步骤；其中，所有步骤在一个集成过程中进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法的所有步骤连续进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白质的分子量为250kDa以上，优选所述蛋白质的分子量为500kDa以上。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤之前包含蛋白质的流体中的蛋白质浓度低于20μg/mL，优选在0.05～20μg/mL之间。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是凝血因子。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述蛋白质是凝血因子VIII。7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是血管性血友病因子。8.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的蛋白质复合物。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤中，使用沉淀剂沉淀蛋白质。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述沉淀剂选自如下：磷酸钙、聚乙二醇(PEG)、亲和配体、pH调节剂、有机溶剂如乙醇或丙酮、聚电解质如聚丙烯酸或聚乙烯亚胺，以及盐类。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述沉淀剂包括磷酸盐。12.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂是磷酸钙、磷酸镁或磷酸锌。13.根据权利要求9～12中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂为磷酸钙。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体中添加钙离子。15.根据权利要求14所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～50mM，优选10～30mM。16.根据权利要求14所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～20mM，优选约15mM。17.根据权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体添加磷酸根离子。18.根据权利要求17所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～10mM，优选1～5mM。19.根据权利要求17所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～3mM，优选约2mM。20.根据权利要求9～19中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括混合包含蛋白质和沉淀剂的流体。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述混合在选自如下的至少一种反应器中进行：连续搅拌釜反应器(CSTR)、管式反应器(TR)、分段流动反应器和冲击射流反应器。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述混合在连续搅拌釜反应器(CSTR)中进行。23.根据权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之前，将所述流体的pH调整至8.5～9.0，优选将pH调整至约8.75。24.根据权利要求1～23中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之后，所述流体的pH在6～7.5之间，优选6.5～7，最优选约6.5。25.根据权利要求1～24中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器、连续切向流过滤或流化床离心用于从流体中分离沉淀的蛋白质。26.根据权利要求1～25中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器用于从流体中分离沉淀的蛋白质。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器为斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于使沉淀蛋白质沉降，所述沉降通道从下部延伸到上部，在使用期间，斜板式沉降器被配置为定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸到上部，所述至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述沉降通道的长度在20～150cm之间，优选20～100cm，更优选20～80cm，更优选30～70cm，更优选40～60cm，最优选约50cm。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器的至少一个沉降通道连接到底部，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含沉淀蛋白质的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降的沉淀蛋白质，所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述连接到用于蛋白质分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应至一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。31.根据权利要求30所述的方法，其中，与用于蛋白质分离的板式沉降器的同一沉降通道对应的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部的开口流体连接。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中，将所述包含沉淀蛋白质的流体通过所述至少一个入口通道供应至与用于蛋白质分离的板式沉降器连接的底部，并且通过所述至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液，所述洗涤液的密度高于所述包含沉淀蛋白质的流体的密度，以及所述剩余流体通过上部的流体出口排出，所述沉降的沉淀蛋白质通过收集通道排出。33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述洗涤液的密度比所述包含沉淀蛋白质的流
体的密度高0.3～1.5
‰
，优选比所述包含沉淀蛋白质的流体的密度高0.55～1.20
‰
。34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述洗涤液包含Tris和氯化钠。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris和浓度为约272mM的氯化钠。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中，所述洗涤液还包含氯化钙。37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为4～12mM的氯化钙。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris、浓度为约231mM的氯化钠和浓度为约12mM的氯化钙。39.根据权利要求32～38中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液的pH为7.5以上，优选8以上，最优选约8.25。40.根据权利要求32～39中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以固定间隔排出。41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以15～45min、优选约30min的固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以15～45min、优选约30min的固定间隔排出。42.根据权利要求32～41中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量排出。43.根据权利要求1～42中任一项所述的方法，其中，所述方法在蛋白质沉淀步骤之前还包括以下步骤：在流体中培养细胞的蛋白质生产步骤，其中所述细胞生产蛋白质并将蛋白质释放至流体中；和将...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：