时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条及方法技术

时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条及方法，所述试纸条包含BPS完全抗原、时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体。利用5

【技术实现步骤摘要】
时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条及方法


[0001]本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条及方法。

技术介绍

[0002]双酚S(Bisphenol S, BPS)是一种双酚A(Bisphenol A, BPA)的替代品，因为与BPA相比具有更高的热稳定性和光稳定性，被广泛用于生产聚碳酸酯塑料和树脂。但是随着BPS在“BPA
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free”产品中的使用越来越多，其进入环境的潜力也越来越大，导致BPS在各种环境基质和生物样品中时有检出。如太湖水体中BPS的浓度均值为16 ng/L；中国成人尿液样本(n=160)中BPS的检出浓度为0.24
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g/L。研究表明BPS具有激素活性会干扰生物体正常的内分泌功能。如环境浓度的BPS暴露会对斑马鱼发育和生殖产生毒性效应。另外，母体在低浓度的BPS暴露下会导致子代神经和内分泌系统受损。鉴于BPS在环境中具有较高的浓度和毒性效应，因此亟需建立BPS的检测方法。
[0003]目前BPS的检测方法以高效液相色谱和气相色谱
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质谱法为主，上述方法虽然具有较高的精度和准确性，但是其复杂的样品前处理过程和昂贵的设备等问题使上述方法难以普及，限制了BPS的检测工作。免疫学检测方法是利用抗体对抗原的识别作用对BPS进行检测，其中侧流层析免疫试纸条因为具有成本低、分析时间短、简单便携和可现场测量等优点，被大量用于快速检测工作。如基于金纳米颗粒建立了检测吡虫啉的侧流免疫层析试纸条，可有效替代最常用的ELISA检测方法。但是目前常规的BPS测流层析试纸条通常是以胶体金作为标记物，因为其本身背景值较高，且是通过离子吸附的方式与抗体结合，存在结合力较弱等缺点，导致检测灵敏度不高。时间分辨荧光微球，是一种利用稀有金属开发的荧光微球，荧光背景值较低，与常规的荧光标记物相比，更加稳定不易淬灭，另外这种荧光微球表面带有羧基基团，可以与抗体通过共价键连接，结合力更稳定。
[0004]因此本专利技术通过制备了BPS高亲和力和高特异性的单克隆抗体，并将该抗体与时间分辨荧光微球偶联建立BPS的侧流层析试纸条，以期为BPS检测工作提供一种性能良好和检测简便的检测方法。
[0005]
技术实现思路
:本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条及方法，该试纸条具有灵敏、快捷和准确的特点。
[0006]时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条，其特征在于该试纸条包含BPS完全抗原、时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体；所述的BPS完全抗原使用5
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溴戊酸甲酯作为连接臂，所述BPS完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或明胶。
[0007]所述时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体中的BPS单克隆抗体，由权利要求1所述BPS完全抗原制得。
[0008]所述BPS完全抗原通过以下方法制得：
首先称取0.25 g BPS加入50 mL乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5
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溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后将得到的固体过柱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，即获得BPS的半抗原；称取10 mg BPS半抗原、8.9 mg碳酰二亚胺(1
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(3
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Dimethylaminopropyl)
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ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)、6.2 mg N
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羟基琥珀酰亚胺(1
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hydroxy
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pyrrolidinedione, NHS)溶于4 mL N,N
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二甲基甲酰胺(N,N
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Dimethylformamide, DMF)中，室温下避光反应2 h；将上述溶液逐滴加入到2 mL 含有20 mg卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)或者15 mg 牛血清白蛋白(Bovine albumin, BSA)的磷酸缓冲液中，4 ℃反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 M PBS中透析32 h，每8 h更换一次透析液；所得溶液再次离心获得上清液即为完全抗原其中加入卵清蛋白时制得的完全抗原记为BPS
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BSA，作为免疫抗原；加入牛血清白蛋白时制得的完全抗原记为BPS
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OVA，作为包被抗原。
[0009]所述时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体通过以下步骤制备：取0.5 mg 时间分辨荧光微球，加入浓度为0.5 mg/mL EDC和NHS，室温反应30 min后，12000 r/min离心10 min后弃上清液，加入1 mL PBS重新沉淀后，使用超声波震荡均匀，加入总量为0.3 mg BPS单克隆抗体室温反应2 h后，加入终浓度为0.25% 的OVA封闭30 min，离心弃上清后加入抗体复溶液(0.01 M Tris
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HCl，5% 蔗糖，1% OVA，pH8.0)重新悬浮沉淀，即获得时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体。
[0010]所述试纸条通过以下步骤完成组装：将时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗喷涂于玻璃纤维膜后作为结合垫，进行干燥，然后将1.25 mg/mL羊抗鼠抗体和0.18 mg/mL BPS
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BSA喷涂于硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸水垫依次组装于PVC板上后，使用斩切机剪切成4 mm的条状，即为时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条。
[0011]所述时间分辨荧光微球标记的BPS侧流层析试纸条，主要用于环境介质和生物样品中BPS的快速检测。
[0012]专利技术优点本专利技术使用5
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溴戊酸甲酯作为连接臂制备了BPS半抗原，由于其具有更长的碳链，可以使BPS特征基团充分暴露，从而获得具有更高亲和力和特异性的BPS单克隆抗体。随后，使用时间分辨荧光微球作为标记物，由于时间分辨荧光微球通过镧系金属铕制备，具有较低的背景值的同时，荧光更加稳定，便于开发具有较高的灵敏度的检测方法。另外，本专利技术制备的测流层析试纸条操作简单、便于携带、检测成本低廉，无需辅助仪器设备便可完成相应的检测，尤其适用于野外快速检测样品中的BPS。
附图说明
[0013]图1为BPS半抗原合成图。
[0014]图2为BPS完全抗原合成图。
[0015]图3为BPS完全抗原红外光谱鉴定结果图。
[0016]图4为BPS完全抗原聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
[0017]图5为BPS侧流层析试纸条最佳T线和C线优化结果图。
[0018]图6为试纸条对于不同浓度BPS的实际检测图。
[0019]图7为BPS侧流层析试纸条标准曲线。
具体实施方式...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.时间分辨荧光微球建立的双酚S侧流层析试纸条，其特征在于该试纸条包含BPS完全抗原、时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体；所述的BPS完全抗原使用5
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溴戊酸甲酯作为连接臂，所述BPS完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或明胶。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述时间分辨荧光微球标记的BPS单克隆抗体中的BPS单克隆抗体，由权利要求1所述BPS完全抗原制得。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述BPS完全抗原通过以下方法制得：首先称取0.25 g BPS加入50 mL乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5
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溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后将得到的固体过柱纯化，即获得BPS的半抗原；称取10 mg BPS半抗原、8.9 mg碳酰二亚胺、6.2 mg N
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羟基琥珀酰亚胺溶于4 mL N,N
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二甲基甲酰胺中，室温下避光反应2 h；将上述溶液逐滴加入到2 mL 含有20 mg卵清蛋白或者15 mg 牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中，4℃反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 M PBS中透析32 h，每8 h更换一次透析液；所得溶液再次离心获得上清液即为B...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，张振忠，汝少国，滕哈燕，王蔚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：