本发明专利技术提供外泌体检测、分类试纸条，所述试纸条包括样品垫、层析膜、吸水垫和底板；所述层析膜包被任选的质控线和多条检测线，每条检测线上包被至少两种不同功能的蛋白，所述至少两种不同功能的蛋白中的一种为外泌体捕获蛋白；另一种为酶；各条检测线上包被外泌体捕获蛋白不同。本发明专利技术还提供了包含所述试纸条的试剂盒以及利用所述试纸条或试剂盒进行外泌体检测和分类的方法。本发明专利技术的方法操作简便，无需专门的仪器，从而能够满足即时检测的需求；同时，本发明专利技术的方法不仅可以检测外泌体的有无，还可以区分外泌体的多种亚型。还可以区分外泌体的多种亚型。
【技术实现步骤摘要】
检测外泌体的试纸、试剂盒和方法
[0001]本专利技术涉及检测领域。具体地说，本专利技术涉及检测外泌体的试纸条、试剂盒和检测方法。
技术介绍
[0002]外泌体是细胞分泌的一种囊泡，其大小为30nm
‑
150nm。外泌体表面含有较为丰富的四跨膜蛋白比如CD9、CD63、CD81等，这些蛋白与外泌体的形成有关。外泌体包含其母细胞的很多信息，比如蛋白质、核酸、转录因子、细胞表面受体等，因此外泌体成为了一种新的生物标志物。然而，外泌体的数量是动态变化的，且变化量非常大。正常人和患者的不同外泌体亚型的比例、不同正常人之间乃至同一个人在不同时间测得的外泌体亚型的比例都会有变化，因此需要找到合适的方法对外泌体进行检测和分类。
[0003]目前主流的外泌体定量方法包括Nanosight纳米粒子追踪分析(NTA)、可调电阻脉冲传感(TRPS)、高分辨率的流式细胞仪、电子显微镜等。然而，这些方法或需要昂贵的仪器，或者检测结果与实际情况存在偏差，并且无法区分外泌体的亚型。
[0004]System Biosciences开发出了基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的外泌体检测试剂盒。但这些试剂盒需要先用其他手段分离和纯化外泌体；如果需要对外泌体的多个指标进行检测就需要用不同试剂盒分别进行多次实验；并且上述试剂盒还需要借助酶标仪进行检测，无法满足即时检测(POCT)的需求。
[0005]专利申请CN113567668A公开了一种用于外泌体定量的荧光免疫层析试纸条的制备及其应用。然而，该方法依然需要荧光免疫分析仪；并且还需要借助荧光微球进行检测；再者，由于外泌体表面有很多抗原，使得这种外泌体定量方式会发生外泌体的漏检；最后，该方法仅能检测外泌体的一种亚型，不能反映出包含多种外泌体亚型的整体结果。
[0006]因此，本领域急需一种操作简便、成本低并且能够在检测外泌体的有无的同时对外泌体的亚型进行分类的外泌体检测方法。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于外泌体检测的试纸条，所述试纸条能够操作简便地检测外泌体，同时还能对外泌体的亚型进行分类。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种用于外泌体检测的试剂盒。
[0009]本专利技术的还有目的在于提供利用所述试纸条或试剂盒检测样品中的外泌体的方法。
[0010]在第一方面，本专利技术提供一种外泌体检测、分类试纸条，所述试纸条包括样品垫、层析膜、吸水垫和底板；
[0011]其中，所述层析膜包被任选的质控线和多条检测线，每条检测线上包被至少两种不同功能的蛋白，所述至少两种不同功能的蛋白中的一种为外泌体捕获蛋白，优选针对外泌体抗原的特异性抗体；另一种为酶，优选催化底物显色的酶；各条检测线上包被外泌体捕
获蛋白不同。
[0012]在具体的实施方式中，所述酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶；优选过氧化氢酶。
[0013]在具体的实施方式中，所述针对外泌体抗原的特异性抗体是针对外泌体上CD9的特异性抗体、针对CD63的特异性抗体、针对CD81的特异性抗体、HSPA8/Hsc70抗体、HSP90AA1/Hsp90α抗体、HSP90AB1/Hsp90β抗体、ALIX抗体、FLOT2抗体、FLOT1抗体、HSPA4/Hsp70抗体、ACTB抗体、RAP1B抗体、Tim4抗体、Moesin抗体、A2M抗体、Gelsolin抗体、B2M抗体、Filamin A抗体等抗体；优选针对外泌体上CD9的特异性抗体、针对CD63的特异性抗体或针对CD81的特异性抗体。
[0014]在优选的实施方式中，所述检测线可以是3条，也可以少于3条，也可以多于3条。
[0015]在具体的实施方式中，层析膜上在检测线外的其他位置也可以有所述酶。
[0016]在具体的实施方式中，所述样品垫与层析膜部分重叠，层析膜与吸水垫部分重叠，样品垫与吸水垫不重叠，样品垫、层析膜和吸水垫置于底板上。
[0017]在优选的实施方式中，所述多条检测线之间的间距为4
‑
8mm，优选6mm。
[0018]在优选的实施方式中，所述外泌体检测、分类试纸条用来检测外泌体的有无，以及对外泌体亚型进行分类。
[0019]在第二方面，本专利技术提供一种外泌体检测、分类试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的外泌体检测、分类试纸条以及利用所述试纸条对样品中的外泌体进行检测和分类的使用说明书。
[0020]在优选的实施方式中，所述外泌体检测、分类试纸条装在卡盒中，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和读卡窗口，所述外泌体检测、分类试纸条置于下盖中，所述加样窗口和读卡窗口分别对应于所述外泌体检测、分类试纸条上的样品垫和质控线及检测线。
[0021]在具体的实施方式中，所述试剂盒还包括与所述试纸条上包被的酶相对应的显色底物和外泌体分离柱。
[0022]在优选的实施方式中，所述显色底物为含有本身不显色或颜色较淡，遇到酶催化后会产生颜色和/或颜色变深和/或颜色改变的物质的溶液。
[0023]在优选的实施方式中，所述显色底物为脂溶性。
[0024]在具体的实施方式中，所述显色底物为3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)和/或二氨基联苯胺(DAB)和/或3
‑
氨基
‑9‑
乙基咔唑(AEC)和/或2,2'
‑
联氨
‑
双
‑
[3
‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸]‑
二氨盐(ABST)和/或邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和/或对硝基苯磷酸盐(PNPP)和/或邻硝基苯
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷(ONPG)的溶液。
[0025]在具体的实施方式中，所述试剂盒中还包含辅助显色试剂和/或洗脱剂。
[0026]在具体的实施方式中，所述辅助显色试剂是辅助显色底物显色的试剂；优选地，所述辅助显色试剂是辅助与外泌体结合的显色底物显色的试剂；更优选地，所述辅助显色试剂是含有过氧化物的溶液；例如过氧化氢(H2O2)的溶液。
[0027]在具体的实施方式中，所述洗脱剂为等渗溶液；优选生理盐水(0.9％的NaCl溶液)、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)。
[0028]在第三方面，本专利技术提供一种制备第一方面所述的外泌体检测、分类试纸条的方法，包括以下步骤：
[0029](1)层析膜的包被：层析膜至少经过两轮包被；第一轮使用划膜仪将多种外泌体捕获蛋白分别包被在层析膜的多条检测线上；第二轮使用划膜仪将酶分别包被在层析膜的上述多条检测线上，从而使得每条检测线同时含有外泌体捕获蛋白以及酶；任选地，所述酶包被在检测线上的同时还可以包被在层析膜非检测线的其他区域；
[0030](2)试纸条的组装：将样品垫、步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种外泌体检测、分类试纸条，所述试纸条包括样品垫、层析膜、吸水垫和底板；其中，所述层析膜包被任选的质控线和多条检测线，每条检测线上包被至少两种不同功能的蛋白，所述至少两种不同功能的蛋白中的一种为外泌体捕获蛋白，优选针对外泌体抗原的特异性抗体；另一种为酶，优选催化底物显色的酶；各条检测线上包被外泌体捕获蛋白不同。2.如权利要求1所述的外泌体检测、分类试纸条，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶；优选过氧化氢酶。3.如权利要求1所述的外泌体检测、分类试纸条，其特征在于，所述针对外泌体抗原的特异性抗体是针对外泌体上CD9的特异性抗体、针对CD63的特异性抗体、针对CD81的特异性抗体、HSPA8/Hsc70抗体、HSP90AA1/Hsp90α抗体、HSP90AB1/Hsp90β抗体、ALIX抗体、FLOT2抗体、FLOT1抗体、HSPA4/Hsp70抗体、ACTB抗体、RAP1B抗体、Tim4抗体、Moesin抗体、A2M抗体、Gelsolin抗体、B2M抗体、Filamin A抗体等抗体；优选针对外泌体上CD9的特异性抗体、针对CD63的特异性抗体或针对CD81的特异性抗体。4.如权利要求1所述的外泌体检测、分类试纸条，其特征在于，层析膜上在检测线外的其他位置也可以有所述酶。5.如权利要求1所述的外泌体检测、分类试纸条，其特征在于，所述样品垫与层析膜部分重叠，层析膜与吸水垫部分重叠，样品垫与吸水垫不重叠，样品垫、层析膜和吸水垫置于底板上。6.一种外泌体检测、分类试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1
‑
5中任一项所述的外泌体检测、分类试纸条以及利用所述试纸条对样品中的外泌体进行检测和分类的使用说明书。7.如权利要求6所述的外泌体检测、分类试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括与所述试纸条上包被的酶相对应的显色底物和外泌体分离柱。8.如权利要求7所述的外泌体检测、分类试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)和/或二氨基联苯胺(DAB)和/或3
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氨基
‑9‑
乙基咔唑(AEC)和/或2,2'
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联氨
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双
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[3
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乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸]
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二氨盐(ABST)和/或邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和/或对硝基苯磷酸盐(PNPP)和/或邻硝基苯
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β
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D
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吡喃半乳糖苷(ONPG)的溶液。...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛滔，张亚楠，陈春竹，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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