荧光-pH生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光

【技术实现步骤摘要】
荧光
‑
pH生物传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种荧光
‑
pH生物传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]pH传感器一直是科研和商业化领域的重要研究对象。传统pH传感器是基于拉曼光谱的颜色传感器，如酚红、甲基橙、孔雀石绿等，这也是pH试纸测量pH的原理。这类pH检测方法可以通过直观的视觉颜色比对来确定pH的大致范围，广泛应用于环境和溶液的pH检测中。但是，基于拉曼光谱的颜色传感器在高通量筛选中数据处理的通量很低，不仅需要额外的图像识别和处理软件，而且处理速率只有10 Hz/s左右。而基于荧光的生物传感器处理速率可达数千Hz/s。因此，基于拉曼光谱的pH生物传感器难以应用于大通量生物筛选平台上。
[0003]pH变化是许多催化反应的共同现象。如产酸菌或者产碱菌在发酵过程中会发生明显的pH迁移，迁移程度与产物的产量呈明显的正比。如甲酸脱氢酶在固定二氧化碳的时候，会产生甲酸的终产物，最终导致反应体系pH向酸性迁移。如基因诊断过程中使用到的环介导等温扩增技术（LAMP），在聚合酶延伸过程中不断产生焦磷酸，过量积累的焦磷酸会导致pH快速下降，最终在基于拉曼光谱的颜色传感器中发生颜色的变化，从而达到快速检测基因的目的。因此，基于pH变化的催化反应在商业上具有重要的应用价值。这类酶的高活性变体的高通量筛选也是行业内亟待解决的问题。
[0004]为了解决基于拉曼光谱的颜色传感器在pH筛选中通量低、数据处理困难等问题，许多公司也在开发基于荧光的pH传感器，如赛默飞世尔公司的pHrodo
™ꢀ
pH Sensor Dyes。这类试剂可以进入到细胞内，对不同亚细胞器内部的pH变化进行实时监控，受到广泛的关注。但仍存在灵敏度低、pH线性不明显、检测范围窄、特异性低、细胞毒性大等问题。因此难以应用在细胞高通量筛选上。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种荧光
‑
pH生物传感器，可用于微流控或者流式分选。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种荧光
‑
pH生物传感器，包括：由单体传感蛋白交联而成的多聚传感蛋白 ；pH响应荧光混合物，所述荧光混合物共价交联到多聚传感蛋白上。
[0007]单体传感蛋白选用富含天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸的蛋白，其中天冬酰胺和谷氨酸的羧基支链用于蛋白的交联，赖氨酸和精氨酸的氨基支链用于标记荧光物质。
[0008]优选的，所述单体传感蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、刀豆球蛋白、络蛋白、卵清蛋白、牛球蛋白或粘蛋白 。
[0009]优选的，所述单体传感蛋白的交联方法为重氮化法、戊二醛法、甲醛法、过碘酸盐氧化法、混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法、二异氰酸酯法、偶氮苯甲酸法、O
‑
羧甲酸羟胺法、对肼基苯甲酸法、多元酸酐法、叠氮化法、氯乙酸钠法、亚胺酸酯法或卤代硝基苯法 。
[0010]优选的，所述pH响应荧光混合物从7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素、7
‑
甲氧基
‑4‑
羧基香豆素、7
‑
羟基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
羟基
‑4‑
甲基香豆素
‑3‑
乙酸、7
‑
羟基
‑4‑
甲基香豆素
‑3‑
乙酸琥珀酰亚胺酯、4
‑
氨基香豆素、异硫氰酸荧光素酯、5（6）
‑
羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯、5（6）
‑
羧基荧光素二乙酸酯、5(6)
‑
羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、罗丹明 B、2
‑
(2
′‑
羟基苯基)苯并噻唑中选择。pH响应荧光物质是指能够响应pH变化产生荧光的物质，但荧光物质单体响应的范围较窄，因此本专利技术在制备传感器时选择多荧光物质组合，以提高对pH反应的灵敏度和响应范围。
[0011]优选的，所述pH响应荧光混合物为7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素、异硫氰酸荧光素酯、5（6）
‑
羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯和2
‑
(2
′‑
羟基苯基)苯并噻唑的混合物。
[0012]优选的，所述荧光
‑
pH生物传感器的分子量在100KDa以上。
[0013]上述的荧光
‑
pH生物传感器在微流控细胞分选中的应用，其步骤包括：（1）将细胞混合物与荧光
‑
pH生物传感器混合，制备单细胞液滴，培养单细胞；（2）液滴通过激光器，激发光波长范围为200nm
‑
450nm，发射光波长范围为510
‑
650 nm；（3）根据发射光强度阈值，为液滴施加电压，改变液滴的分选通道，获得目标细胞。
[0014]上述的荧光
‑
pH生物传感器在菌株或靶标的高通量筛选中的应用，所述菌株为产酸菌株或者产碱菌株、耐酸或耐碱菌株，所述靶标为CO2还原酶变体或Bst聚合酶变体。
[0015]本专利技术还公开了上述的荧光
‑
pH生物传感器的制备方法，其步骤包括：（1）在单体传感蛋白中加入交联剂进行反应，使单体传感蛋白交联成多聚传感蛋白；（2）加入交联终止剂，终止交联反应；（3）将多聚传感蛋白与pH响应荧光混合物混合，调节pH至7，并通过调节各荧光剂的比例至体系为无色，进行反应；（4）回收荧光
‑
pH生物传感器：使用分子筛层析法或超滤法，回收分子量在100 kDa以上的荧光
‑
pH生物传感器。
[0016]在pH7条件下调至无色（肉眼和荧光下都接近无色）的目的是一是降低背景色的干扰，二是让它在酸性条件和碱性条件分别表现出不同波长的荧光，从而可以根据波长区分开来。
[0017]优选的，所述步骤（1）中单体传感蛋白的浓度为1
‑
30 g/L，使用的交联剂为戊二醛或碳二亚胺，交联剂使用浓度为0.1
‑
5 mM，交联时间为5
‑
60 min，交联温度为4
‑
30℃。
[0018]优选的，所述步骤（2）中的交联终止剂为甘氨酸、碳酸氢钠或者碳酸钠，所述交联终止剂的使用浓度为0.1
‑
5 mM，处理时间是5
‑
20 min，处理温度是4
‑
30℃。
[0019]优选的，步骤（3）中pH响应荧光混合物的添加浓度为0.05
‑
1 mM，反应时间是0.5
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光
‑
pH生物传感器，其特征在于包括：由单体传感蛋白交联而成的多聚传感蛋白；pH响应荧光混合物，所述荧光混合物共价交联到多聚传感蛋白上。2.根据权利要求1所述的荧光
‑
pH生物传感器，其特征在于：所述单体传感蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、刀豆球蛋白、络蛋白、卵清蛋白、牛球蛋白或粘蛋白。3.根据权利要求2所述的荧光
‑
pH生物传感器，其特征在于：所述单体传感蛋白的交联方法为重氮化法、戊二醛法、甲醛法、过碘酸盐氧化法、混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法、二异氰酸酯法、偶氮苯甲酸法、O
‑
羧甲酸羟胺法、对肼基苯甲酸法、多元酸酐法、叠氮化法、氯乙酸钠法、亚胺酸酯法或卤代硝基苯法。4.根据权利要求3所述的荧光
‑
pH生物传感器，其特征在于：所述pH响应荧光混合物从7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素、7
‑
甲氧基
‑4‑
羧基香豆素、7
‑
羟基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
羟基
‑4‑
甲基香豆素
‑3‑
乙酸、7
‑
羟基
‑4‑
甲基香豆素
‑3‑
乙酸琥珀酰亚胺酯、4
‑
氨基香豆素、异硫氰酸荧光素酯、5（6）
‑
羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯、5（6）
‑
羧基荧光素二乙酸酯、5(6)
‑
羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、罗丹明 B、2
‑
(2
′‑
羟基苯基)苯并噻唑中选择。5.根据权利要求4所述的荧光
‑
pH生物传感器，其特征在于：所述pH响应荧光混合物为7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素琥珀酰亚胺酯、7
‑
甲氧基
‑3‑
羧基香豆素、异硫氰酸荧光素酯、5（6）
‑
羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯和2

【专利技术属性】
技术研发人员：吴嵩，张志乾，陈西朋，罗元廷，刘丽花，杨敏，江翱，王帆，吴奕瑞，
申请(专利权)人：态创生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：