【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞壁蛋白ppsag1及其应用，属于蛋白表达。
技术介绍
1、莱鲍迪苷a(rebaudioside a，ra)是从甜叶菊(stevia rebaudiana)的叶片中提取具有多种优良特性的高甜度天然甜味剂，占干叶重的2-4％，其甜度是蔗糖的150-300倍，热值仅为蔗糖的1/300，而且口味纯正，没有后苦味，口感比较接近蔗糖，易于被人们接受。高纯度的莱鲍迪苷a作为甜味剂在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。因此，研究开发制备高纯度莱鲍迪苷a的方法具有重要意义[1]。目前制备高纯度莱鲍迪苷a产品的方法主要集中以下几个方面：筛选培育高产莱鲍迪苷a的甜叶菊品种，改善提取莱鲍迪苷a的分离纯化方法等，这些传统方法都存在工艺繁琐、生产成本高、酶法效果不佳等缺点。目前已有研究构建合成莱鲍迪苷a的工程菌进行生物发酵生产莱鲍迪苷a，比如通过在毕赤酵母(pichia pastoris)中共表达蔗糖合成酶(sucrose synthase，sus)和udp-糖基转移酶(udp-glycosyltransferase，ugt)构成全细胞催化体系合成莱鲍迪苷a；或者结合在毕赤酵母胞内表达蔗糖合成酶及表面展示udp-糖基转移酶以合成莱鲍迪苷a，并通过改善发酵工艺来提高毕赤酵母全细胞生物催化的效率。虽然利用毕赤酵母表面展示可在一定程度提高莱鲍迪苷a的产量，但并未有研究评估过不同锚定蛋白对细胞表面展示效果的影响[2]。
2、目前，酵母细胞表面展示已广泛应用于各种领域，如提高蛋白质的产量和热稳定性，cdna文
3、近年来，毕赤酵母因其生长密度高、蛋白翻译后修饰适度、蛋白分泌能力强、培养工艺简单等优势，已逐渐成为最为常用的异源蛋白真核表达平台。毕赤酵母被美国食品药品管理局(fda)认定为美国市场安全可靠(gras)菌株，并获准用于制药和食品行业。已报道的用于毕赤酵母表面展示系统的锚定蛋白主要有源于酿酒酵母的sed1p、aga1p和来源于毕赤酵母的gcw61等[3]，已被成功用于毕赤酵母的展示系统。虽然表面展示具有诸多优点，但仍存在展示蛋白量不高的问题，锚定蛋白本身的性质对被展示的酶活性有较大的影响，表面展示效率仍是制约其使用的关键，因此表达特定蛋白需要挑选合适的锚定蛋白，从而提高毕赤酵母展示的蛋白量。
技术实现思路
1、本专利技术发现了一种细胞壁蛋白ppsag1，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
2、本专利技术还公开了上述的细胞壁蛋白ppsag1的编码基因。
3、优选的，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术还公开了上述的细胞壁蛋白ppsag1在构建重组毕赤酵母工程菌株中的应用。
5、优选的，所述重组毕赤酵母工程菌株表面展示糖基转移酶ugt76g1。
6、本专利技术还公开了一种表面展示表达载体ppic9k-ugt76g1-ppsag1，在ppic9k载体的启动子后连接糖基转移酶ugt76g1的编码基因和细胞壁蛋白ppsag1的编码基因，用于表达糖基转移酶ugt76g1和细胞壁蛋白ppsag1。
7、通常而言，表面展示表达载体包括启动子、5’端非编码区、α-factor分泌肽、ugt76g1编码基因、锚定蛋白编码基因和3’非编码区，其中，所述启动子为组成型启动子aox1。
8、表达载体还可以包括用于转化菌株筛选的选择性标记基因，所述标记基因包括编码抗生素耐受的抗性基因以及营养缺陷型基因。
9、本专利技术还公开了一种重组毕赤酵母工程菌株，其内转化有上述的表面展示表达载体ppic9k-ugt76g1-ppsag1。
10、优选的，所述毕赤酵母为gs115毕赤酵母。
11、本专利技术还公开了上述的重组毕赤酵母工程菌株在制备莱鲍迪苷a中的应用。
12、本专利技术提供了一种细胞壁蛋白ppsag1，利用该细胞壁蛋白ppsag1将ugt76g1在毕赤酵母细胞表面进行表达，可以得到高产莱鲍迪苷a的重组毕赤酵母工程菌株。
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1.一种细胞壁蛋白PpSAG1，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的细胞壁蛋白PpSAG1的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的细胞壁蛋白PpSAG1在构建重组毕赤酵母工程菌株中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌株表面展示糖基转移酶UGT76G1。
6.一种表面展示表达载体pPIC9K-UGT76G1-PpSAG1，其特征在于在pPIC9K载体的启动子后连接糖基转移酶UGT76G1的编码基因和细胞壁蛋白PpSAG1的编码基因。
7.一种重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于其内转化有权利要求6所述的表面展示表达载体pPIC9K-UGT76G1-PpSAG1。
8.根据权利要求7所述的重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于所述毕赤酵母为GS115毕赤酵母。
9.权利要求7或8所述的重组毕赤酵母工程菌株在制备莱鲍迪苷A中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种细胞壁蛋白ppsag1，其特征在于其氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的细胞壁蛋白ppsag1的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.权利要求1所述的细胞壁蛋白ppsag1在构建重组毕赤酵母工程菌株中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌株表面展示糖基转移酶ugt76g1。
6.一种表面展示表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏家秀，张志乾，王帆，吴奕瑞，曾倩，区涣彩，曾逸锋，徐志强，黄侨，王嘉鹏，王海梅，江翱，郑小茂，崔华，杨刚柱，
申请(专利权)人：态创生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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