高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法技术

本发明专利技术公开了一种高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，包括：1)产生条纹状照明光场；2)利用条纹状照明光场分别在不同的条纹方向以及不同的相移步数下照明并激发待测样品产生荧光信号；3)采集荧光信号，获得由不同的条纹状照明光场激发的原始荧光图像；4)利用高速无伪影重建算法处理原始荧光图像，获得超分辨图像。本发明专利技术可以大幅抑制超分辨结构光照明显微图像中的计算伪影，显著提高超分辨图像的保真度；同时还具备毫秒级别的重建速度，为实时成像提供了极大的便利。该方法可以为实现高保真、实时的超分辨显微成像提供一种有力的手段。手段。手段。

【技术实现步骤摘要】
高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法


[0001]本专利技术属于光学
，涉及一种结构光照明显微成像方法，尤其涉及一种可广泛应用于生物学、医学、微电子学及材料科学等领域进行研究的高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法。

技术介绍

[0002]超分辨荧光显微技术能够突破光学系统衍射极限的限制，是光学显微领域的重要研究课题之一。在众多超分辨成像方法中，超分辨结构光照明显微镜(Super
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resolution structured illumination microscopy，SR
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SIM)具有最高的成像速率和最低的激发功率密度(～1W/cm2)，可以进行长时间的动态超分辨观测。另外，线性SR
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SIM与传统的荧光分子、荧光染料兼容，无需特殊的光开关染料或蛋白，大大扩展了超分辨成像的应用范围。这些优势使得SR
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SIM在细胞器、生物大分子及其组装体的动态行为观测中备受青睐。近年来，各种新的技术、设备和算法相继被引入到SR
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SIM中，它的时空分辨率、成像深度获得了极大的提升。
[0003]然而，SR
‑
SIM在生物医学实验室中的应用仍然十分受限，更难如共聚焦显微镜一般，广泛应用于生物医学、微电子学、材料科学等领域的各个角落。其主要原因主要包括两点：其一，主流的SR
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SIM的图像重建算法(流程如图2所示)均基于频率域重建，包含了大量的复杂频域运算后处理，运算耗时通常长达数秒，故无法进行实时的超分辨成像，从而极大地降低了用户的成像效率和用户体验；其二，SR
‑
SIM重建的超分辨图像往往包含了大量的计算伪影，大幅降低了降低精细结构的保真度，从而导致SR
‑
SIM图像无法用于定量荧光分析。这是由于它的合成光学传递函数(Optical transfer function，OTF)与具有双倍分辨率的理想OTF不匹配导致的。
[0004]为了解决SR
‑
SIM重建速度慢的问题，Wang等人提出一种基于空频域混合式重建算法(以下称空频域混合式重建算法，JSFR，专利号：ZL202110985056.7)，大大简化了重构工作流程(流程如图3所示)，将重建速度提升至传统方法的80倍以上。这种方式将传统重建流程中大部分步骤简化为实空间中简单的乘法和求和运算，在不牺牲图像质量的前提下大大缩短了重建算法的执行时间。这种改进的重建方法的意义在于，显微镜使用者能够像使用传统的共聚焦显微镜一样使用SR
‑
SIM，而不用在宽场模式和SR
‑
SIM模式之间来回切换，大大提高了他们的工作效率，故很好地解决了上述第一个问题。然而，这种方法的重建结果本质上与传统的基于频率域的重建算法是完全等价的，它的合成光学传递函数(Optical transfer function，OTF)与具有双倍分辨率的理想OTF之间也存在显著差异。更准确的说，它的合成OTF在“中频”区域也存在扭结分布，故也会在图像中产生旁瓣状的计算伪影，从而大幅降低图像的保真度。这使得SR
‑
SIM获得的图像难以应用于定量荧光分析，从而限制了它在各个领域的广泛应用。

技术实现思路

[0005]为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种同时具备高重建速度的、高保真度的、能够在不牺牲重建速度的前提下解决JSFR算法合成OTF与理想OTF不匹配的问题的高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，其特征在于：所述高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法包括以下步骤：
[0008]1)产生条纹状照明光场，条纹状照明光场的强度分布表示为：
[0009][0010]其中：
[0011]r为二维实空间的坐标；
[0012]d为不同的条纹方向，d＝1，2，3；
[0013]i为不同的相移步数，i＝1，2，3；
[0014]I
d
为条纹状照明光场的平均光强；
[0015]m
d
为条纹状照明光场的调制度；
[0016]k
d
为条纹的波矢量；
[0017]为当前照明光场对应的相位；
[0018]2)利用步骤1)得到的条纹状照明光场分别在不同的条纹方向以及不同的相移步数的情况下照明并激发待测样品产生荧光信号；
[0019]3)采集荧光信号，获得由不同的条纹状照明光场激发的原始荧光图像；
[0020]4)利用高速无伪影超分辨重建方法处理原始荧光图像，获得无伪影的超分辨图像。
[0021]上述步骤4)的具体实现方式是：
[0022]4.1)计算每幅原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)：
[0023]根据每个条纹状照明光场的调制度m
d
、条纹照明光场的波矢量k
d
以及各条纹状照明光场的相位计算出每幅原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)；
[0024]4.2)计算衰减函数a(k)以及频谱优化函数
[0025]所述衰减函数a(k)为高斯分布，其中k为频谱空间的坐标；设光学系统的光学传递函数为频谱优化函数由参数微调的两个衰减函数、光学系统的光学传递函数以及步骤4.1)中的光场参数求得；
[0026]4.3)对原始荧光图像进行预处理滤波：
[0027]通过预处理滤波器分别对步骤3)所采集得到的原始荧光图像进行预处理滤波，得到滤波图像
[0028]4.4)点乘：
[0029]将步骤4.3)得到的滤波图像分别与步骤4.1)计算得到的权重图像w
d，i
(r)相点乘，并将所有相乘的结果叠加，得到未优化的超分辨图像I
SR_woOpt
(r)；
[0030]4.5)进行频谱优化：
[0031]利用步骤4.2)中计算得到的频谱优化函数对步骤4.4)中得到的未优化的超分辨图像I
SR_woOpt
(r)进行频谱优化，并变换至实空间，获得最终的无伪影的超分辨图像I
SR
(r)。
[0032]上述步骤4.1)中原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)的表达式是：
[0033][0034]其中：
[0035]m
d
为条纹状照明光场的调制度；
[0036]k
d
为条纹照明光场的波矢量；
[0037]为条纹状照明光场的初始相位；
[0038]为相移量。
[0039]上述步骤4.2)中的衰减函数的表达式是：
[0040][0041]其中：
[0042]k为频谱空间的坐标；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，其特征在于：所述高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法包括以下步骤：1)产生条纹状照明光场，条纹状照明光场的强度分布表示为：其中：r为二维实空间的坐标；d为不同的条纹方向，d＝1，2，3；i为不同的相移步数，i＝1，2，3；I
d
为条纹状照明光场的平均光强；m
d
为条纹状照明光场的调制度；k
d
为条纹的波矢量；为当前照明光场对应的相位；2)利用步骤1)得到的条纹状照明光场分别在不同的条纹方向以及不同的相移步数的情况下照明并激发待测样品产生荧光信号；3)采集荧光信号，获得由不同的条纹状照明光场激发的原始荧光图像；4)利用高速无伪影超分辨重建方法处理原始荧光图像，获得无伪影的超分辨图像。2.根据权利要求1所述的高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，其特征在于：所述步骤4)的具体实现方式是：4.1)计算每幅原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)：根据每个条纹状照明光场的调制度m
d
、条纹照明光场的波矢量k
d
以及各条纹状照明光场的相位计算出每幅原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)；其中r为二维实空间的坐标；4.2)计算衰减函数a(k)以及频谱优化函数所述衰减函数a(k)为高斯分布，其中k为频谱空间的坐标；设光学系统的光学传递函数为频谱优化函数由参数微调的两个衰减函数、光学系统的光学传递函数以及步骤4.1)中的光场参数求得；4.3)对原始荧光图像进行预处理滤波：通过预处理滤波器分别对步骤3)所采集得到的原始荧光图像进行预处理滤波，得到滤波图像4.4)点乘：将步骤4.3)得到的滤波图像分别与步骤4.1)计算得到的权重图像w
d，i
(r)相点乘，并将所有相乘的结果叠加，得到未优化的超分辨图像I
SR_woOpt
(r)；4.5)进行频谱优化：利用步骤4.2)中计算得到的频谱优化函数对步骤4.4)中得到的未优化的超分辨图像I
SR_woOpt
(r)进行频谱优化，并变换至实空间，获得最终的无伪影的超分辨图像I
SR
(r)。3.根据权利要求2所述的高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，其特征在于：所述步骤4.1)中原始荧光图像对应的权重图像w
d，i
(r)的表达式是：其中：m
d
为条纹状照明光场的调制度；k
d
为条纹照明光场的波矢量；为条纹状照明光场的初始相位；为相移量。4.根据权利要求2所述的高速无伪影超分辨结构光照明显微成像方法，其特征在于：所述步骤4.2)中的衰减函数的表达式是：其中：k为频谱空间的坐标；a
att
为衰减幅度参数，取值范围为从0～1；k
σ
为可调的经验参数；所述步骤4.2)中频谱优化函数是两个频谱优化子函数和的乘积，即两个频谱优化子函数的表达式分别为：两个频谱优化子函数的表达式分别为：其中：m＝
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪召军，雷铭，梁言生，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：