基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法技术

本发明专利技术公开了基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，涉及疟疾监测技术领域，其技术方案要点是：将间日疟原虫裂殖子表面蛋白MSP

【技术实现步骤摘要】
基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法


[0001]本专利技术涉及疟疾监测
，更具体地说，它涉及基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法。

技术介绍

[0002]疟疾被世界卫生组织(WHO)列为全球三大公共卫生问题之一，在全球范围内造成严重的疾病负担。近年来随着一系列控制措施的开展，如预防性服药和以青蒿素为基础的联合用药等，许多国家的疟疾防控取得了显著成果并逐步迈向消除或消除后阶段。在该阶段，保持疟疾零传播状态、防止再传播是消除后国家的首要任务，因此加大对疟疾暴露风险的监测变得愈发重要。
[0003]疟疾消除后地区人群的暴露风险监测中，高灵敏度的血清学监测方法逐渐受到重视。许多研究表明，感染者体内疟原虫清除后，大部分抗体仍能持续数月甚至数年(具体时间取决于相应抗体的半衰期)，对抗体标志物的检测可以反映人群既往和目前暴露情况。同时，将人群各年龄段抗体阳性率数据拟合合适的催化模型，还可以预测人群的年感染概率，评估人群的暴露风险，因此，血清学监测方法可以作为疟疾消除后阶段监测的重要补充工具，建立基于重组抗原的血清学监测方法也是疟疾消除地区研究的重点。
[0004]间日疟是一种由间日疟原虫引起的疟疾，其特征是每48小时重复发作一次。它的主要特征是热前冷，出汗后恢复，两次发作时表现正常。它的传播媒介是中华按蚊。
[0005]现有技术中对于间日疟疾的监测，常用是采用基于间接ELISA法的ELISA试剂盒进行检测分析，该现有常用方法的敏感性、检出效率和对高风险阴性人群的筛查能力较低，且ELISA试剂盒不能区分具体虫种。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，本专利技术的方法是基于蛋白质芯片技术的疟疾血清学监测方法，该方法的敏感性高，检出效率好，对高风险阴性人群检出率高，能筛选出既往疟疾感染史人群；同时，该方法的特异性和板间操作一致性好，可作为疟疾消除和消除后阶段高效的血清学监测工具。
[0007]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，将间日疟原虫裂殖子表面蛋白 MSP
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和环子孢子蛋白CSP作为特异性抗原包被在蛋白质芯片上，通过倍比稀释法筛选抗原并确定滤纸血洗脱血清稀释倍数和筛选抗原的最佳包被浓度，具体包括以下步骤：
[0008]S1、芯片点制：
[0009]取一张包含14个区域，每个区域含256个孔的芯片，将经过倍比稀释的PvMSP
‑
119和PvCSP抗原通过点样仪点样于芯片的一个区域的256孔中，点样完成后，将芯片置于点样仪基片载台固定过夜，然后再将其放置于4℃冰箱内保存；
[0010]S2、滤纸干血滴样本洗脱：
[0011]将间日疟阳性质控血清对应的20例滤纸干血滴样本和10例阴性质控对应的滤纸干血滴样本洗脱，然后从903滤纸上剪下血量20μl 的滤纸并置于由PBS、0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Tween20组成的1ml洗脱液中，于4℃轻摇过夜洗脱，洗脱液用于后续检测；
[0012]S3、确定抗原包被浓度和滤纸血洗脱血清稀释倍数：
[0013]1)将步骤S1中点制的芯片由4℃冰箱取出恢复至室温，将其与围栏贴合后加入100uL 3％BSA封闭液到孔中，室温封闭1h；
[0014]2)除去封闭液，将步骤S2中的20例阳性质控滤纸血洗脱血清混合，并按照4倍稀释(1:1、1:4、1:16、1:64、1:256)，然后各取 100μl加入步骤S1中点制芯片的左侧5个区域内；
[0015]3)将10例阴性质控滤纸血洗脱血清混合按步骤2)的标准稀释后加入点制芯片右侧5个区域内；点制芯片上的其他1个区域加间日疟阳性质控品血清作阳性对照，1个区域加阴性质控品混合血清作阴性对照，2个区域做空白对照，室温反应2h；
[0016]4)使用PBS清洗3次，每次5min；除尽清洗液，将稀释后的鼠抗人IgG
‑
Cy3和羊抗人IgM
‑
Cy5混合二抗加入到孔中，室温避光反应 1h；使用PBS再次清洗后拆出围栏，甩干芯片，采用Axon扫描仪扫描芯片，并根据检测结果筛选抗原，确定筛选出抗原的最佳包被浓度和滤纸血洗脱血清稀释倍数。
[0017]进一步地，步骤S1中的PvMSP
‑
119为3个，且倍比稀释浓度分别为：0.025μg/μL、0.05μg/μL、0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL 和0.8μg/μL；PvCSP抗原为1个且倍比稀释浓度为0.025μg/μL、0.05μg/μL、0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL和0.8μg/μL。
[0018]进一步地，3个PvMSP
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抗原和1个PvCSP抗原中的每个抗原的每种浓度各重复点样于芯片一个区域的256孔中4次。
[0019]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]1、本专利技术的方法是基于蛋白质芯片技术的疟疾血清学监测方法，对于间日疟，该方法的敏感性高，检出效率好，对高风险阴性人群检出率高，能筛选出既往疟疾感染史人群；
[0021]2、本专利技术的方法与现有的间接ELISA法的检测效率相当，并且对高风险地区阴性人群的血清阳性检出率高，能筛选出既往疟疾感染史患者；同时，与ELISA试剂盒不能区分具体虫种相比，该方法的抗原可以检测出间日疟血清阳性者，弥补了间接ELISA试剂盒的不足；
[0022]3、通过本专利技术的方法，在掌握疟疾消除后地区人群一段时间的疟疾暴露情况等方面具有重要的应用价值，可作为消除后地区疟疾监测的重要补充工具。
附图说明
[0023]图1是本专利技术实施例中芯片布局图；
[0024]图2是本专利技术实施例中不同种类抗原不同包被浓度下与阳性质控品反应的MFI值变化图；
[0025]图3是本专利技术实施例中筛选抗原浓度与阳性质控品MFI值的相关性分析图；
[0026]图4是本专利技术实施例中滤纸血洗脱血清不同稀释倍数下的芯片扫描图；
[0027]图5是本专利技术实施例中筛选抗原与滤纸血洗脱血清反应的MFI值变化图；
[0028]图6是本专利技术实施例中包被浓度梯度下筛选抗原与4倍稀释的滤纸血洗脱血清反
应的MFI值变化图；
[0029]图7是本专利技术实施例中基于蛋白质芯片技术的疟疾血清学监测方法和间接ELISA法的ROC曲线比较分析图；
[0030]图8是本专利技术实施例中有无既往感染史人群检测结果的差异性；
[0031]图9是本专利技术实施例中本专利技术的方法的抗原特异性验证数据图；
[0032]图10是本专利技术实施例中质控品的板间相关性图。
具体实施方式
[0033]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术的实施例及附图，对本专利技术的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于间日疟重组蛋白的疟疾血清学监测方法，其特征是：将间日疟原虫裂殖子表面蛋白MSP
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和环子孢子蛋白CSP作为特异性抗原包被在蛋白质芯片上，通过倍比稀释法筛选抗原并确定滤纸血洗脱血清稀释倍数和筛选抗原的最佳包被浓度，具体包括以下步骤：S1、芯片点制：取一张包含14个区域，每个区域含256个孔的芯片，将经过倍比稀释的PvMSP
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和PvCSP抗原通过点样仪点样于芯片的一个区域的256孔中，点样完成后，将芯片置于点样仪基片载台固定过夜，然后再将其放置于4℃冰箱内保存；S2、滤纸干血滴样本洗脱：将间日疟阳性质控血清对应的20例滤纸干血滴样本和10例阴性质控对应的滤纸干血滴样本洗脱，然后从903滤纸上剪下血量20μl的滤纸并置于由PBS、0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.3％Tween20组成的1ml洗脱液中，于4℃轻摇过夜洗脱，洗脱液用于后续检测；S3、确定抗原包被浓度和滤纸血洗脱血清稀释倍数：1)将步骤S1中点制的芯片由4℃冰箱取出恢复至室温，将其与围栏贴合后加入100uL 3％BSA封闭液到孔中，室温封闭1h；2)除去封闭液，将步骤S2中的20例阳性质控滤纸血洗脱血清混合，并按照4倍稀释(1:1、1:4、1:16、1:64、1:256)，然后各取100μl加入步骤S1中点制芯片的左侧5个区域内；3)将10例阴性...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏志贵，崔延雯，黄芳，尹建海，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心，
类型：发明
国别省市：