一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法技术

本发明专利技术涉及胶体金检测试纸条制备技术领域，具体公开了一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，通过分别制备兔抗

【技术实现步骤摘要】
一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法


[0001]本专利技术属于胶体金检测试纸条制备
，具体涉及一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法。

技术介绍

[0002]维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种革兰氏阴性杆菌，可包括泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[7]、锦鲤(Cyprinus carpio)[8]、斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)[9]等在内的多种水产动物，引起鱼类发病并大量死亡。该菌广泛分布于水体环境中，夏、秋两季繁殖较快，特别是水质恶化、水产动物机体创伤或免疫力降低时，能引起很高的死亡率，多为温和生物型的感染，患病动物以出血和腹水为主要病理特征。
[0003]斑点叉尾鮰多表现为体表(头部、鳃盖、口部、下颌、腹部、鳍条及其他体表部位)有不同程度的充血和出血现象，个别病例中有1～2尾鱼有蛀鳍、或体表皮肤和肌肉溃烂、或腹部膨大等症状；剖检见肝、脾、肾等脏器主要表现为不同程度的肿胀、充血、出血，肝脏常因失血呈色淡、质脆或呈红黄相间的花斑状等，有的胆囊膨胀，肠黏膜充血、出血，肠道内含有不等量的黏液(淡黄色或红色胶冻状)，少数病鱼腹腔内积有不等量的腹水(淡黄色的接近透明或不透明、溶血性腹水、或形成胶胨状等)。通过对病原进行分离纯化，结合生化鉴定和16S rDNA基因测序分析，判定为A.veronii感染所致。
[0004]目前，对于A.veronii的检测，除了最传统的生化鉴定，其余主要采用： (1)平板分离培养法，再结合16srDNA或gyrB鉴定，完成一个检测周期约 7
‑
10d，同时需要专业技术人员操作，要求较高。(2)分子生物学的方法，如PCR法进行诊断，该类方法依赖于贵重的仪器设备和专业的技术人员，检测时间长约4
‑
6个小时，不利于在基层推广。(3)利用免疫学ELISA诊断，同样面临耗时长、设备和技术要求较高等缺陷；因此我们需要提出一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，通过该方法可解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1、兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体制备，包括灭活疫苗的制备、安全测试、收集灭活A.veronii、家兔免疫及血清收集、血清IgG纯化和玻片凝集法测定兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体效价；
[0009]S2、兔抗维氏气单胞菌LamB多克隆抗体制备，包括 Rosetta(DE3)
‑
pET
‑
b2m
‑
LamB表达菌株构建、LamB蛋白的诱导表达、SDS
‑
PAGE、重组蛋白LamB的大量诱导与纯化、兔抗LamB蛋白多克隆抗体的制备、兔抗 LamB蛋白多克隆抗体的纯化和玻片凝集法测定兔抗
LamB蛋白多克隆抗体的效价；
[0010]S3、金标
‑
兔抗LamB多克隆抗体制备，包括柠檬酸三钠最佳加入量的优化、兔抗
‑
LamB多克隆抗体的抗体标记浓度和pH优化和金标
‑
LamB抗体的制备；
[0011]S4、目标金标垫的预处理与制备，包括金标垫的预处理和金标
‑
LamB金标垫的制备；
[0012]S5、硝酸纤维膜处理与TC线制备，包括NC膜的预处理、T线的制备和C 线的制备；
[0013]S6、试纸条组装，按照顺序依次组装：样品垫、金标垫、包被有T线和C 线的NC膜、吸水垫依次贴于PVC板上，按照卡壳大小，将组装的PVC板，平均切成0.5cm宽的小条，装入卡壳内。
[0014]优选的，步骤1中所述灭活疫苗的制备时将A.veronii接种至LB肉汤， 28℃200r/min震荡培养24h，麦氏比浊管调节细菌浓度至5
×
108cfu/mL，按体积比的8
‰
添加甲醛，28℃200r/min震荡灭活48h；
[0015]所述安全性测试将灭活菌液涂布于BHI培养基上，28℃培养48h，检查菌落生长状况；吸取少量灭活菌液加入10mLBHI肉汤中，28℃，培养48h，检查肉汤中菌液生长情况；
[0016]所述收集灭活A.veronii是确认无菌生长后，将灭活菌液离心15min，离心温度为28℃、转速为9000rpm，弃上清，沉淀用无菌PBS反复洗涤3次，以除去残留甲醛，用PBS将菌液配制成1
×
108cfu/mL，4℃保存；
[0017]所述家兔免疫及血清收集将家兔暂养14d，无明显临床症状的健康家兔，按照免疫程序进行免疫，免疫前一天对家兔进行抽血，分离血清作为阴性对照；四免后第7天进行颈动脉放血收集，37℃静置30min，4℃冰箱过夜，当析出血清时，血凝块离心，5000r/min，15min；再次收集血清，
‑
20℃冰箱保存
[0018]优选的，所述血清IgG纯化是利用饱和硫酸铵沉淀法进行血清纯化，纯化步骤如下：
[0019]A1、取5mL血清，加生理盐水5ml，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5mL，使成20％硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min；
[0020]A2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白；
[0021]A3、在上清液中再加饱和硫酸铵溶液7.5mL，使成50％硫酸铵溶液，充分混合，静置30min；
[0022]A4、3000r/min离心20min，弃上清；
[0023]A5、于沉淀中加5mL生理盐水，使之溶解，再加饱和硫酸铵2.5mL，使成 33％硫酸铵溶液，充分混合后，静置30min；
[0024]A6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白；重复步骤A5，2
‑
3 次；
[0025]A7、用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO
42
‑
：取3
‑
4mL透析液，加试剂1
‑
2滴，出现沉淀则表明有SO
42
‑
存在；透析直至无沉淀出现为止；
[0026]A8、离心去沉淀，上清液即为粗提IgG，纯化后的血清冻存于
‑
20℃备用。
[0027]优选的，所述玻片凝集法测定兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体效价时灭活的A.veronii调节浓度至1
×
108cfu/mL；将纯化的IgG使用PBS2倍的倍比稀释，即倍比为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64或1:12本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体制备，包括灭活疫苗的制备、安全测试、收集灭活A.veronii、家兔免疫及血清收集、血清IgG纯化和玻片凝集法测定兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体效价；S2、兔抗维氏气单胞菌LamB多克隆抗体制备，包括Rosetta(DE3)
‑
pET
‑
b2m
‑
LamB表达菌株构建、LamB蛋白的诱导表达、SDS
‑
PAGE、重组蛋白LamB的大量诱导与纯化、兔抗LamB蛋白多克隆抗体的制备、兔抗LamB蛋白多克隆抗体的纯化和玻片凝集法测定兔抗LamB蛋白多克隆抗体的效价；S3、金标
‑
兔抗LamB多克隆抗体制备，包括柠檬酸三钠最佳加入量的优化、兔抗
‑
LamB多克隆抗体的抗体标记浓度和pH优化和金标
‑
LamB抗体的制备；S4、目标金标垫的预处理与制备，包括金标垫的预处理和金标
‑
LamB金标垫的制备；S5、硝酸纤维膜处理与TC线制备，包括NC膜的预处理、T线的制备和C线的制备；S6、试纸条组装，按照顺序依次组装：样品垫、金标垫、包被有T线和C线的NC膜、吸水垫依次贴于PVC板上，按照卡壳大小，将组装的PVC板，平均切成0.5cm宽的小条，装入卡壳内。2.根据权利要求1所述的一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤1中所述灭活疫苗的制备时将A.veronii接种至LB肉汤，28℃200r/min震荡培养24h，麦氏比浊管调节细菌浓度至5
×
108cfu/mL，按体积比的8
‰
添加甲醛，28℃200r/min震荡灭活48h；所述安全性测试将灭活菌液涂布于BHI培养基上，28℃培养48h，检查菌落生长状况；吸取少量灭活菌液加入10mLBHI肉汤中，28℃，培养48h，检查肉汤中菌液生长情况；所述收集灭活A.veronii是确认无菌生长后，将灭活菌液离心15min，离心温度为28℃、转速为9000rpm，弃上清，沉淀用无菌PBS反复洗涤3次，以除去残留甲醛，用PBS将菌液配制成1
×
108cfu/mL，4℃保存；所述家兔免疫及血清收集将家兔暂养14d，无明显临床症状的健康家兔，按照免疫程序进行免疫，免疫前一天对家兔进行抽血，分离血清作为阴性对照；四免后第7天进行颈动脉放血收集，37℃静置30min，4℃冰箱过夜，当析出血清时，血凝块离心，5000r/min，15min；再次收集血清，
‑
20℃冰箱保存。3.根据权利要求1所述的一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述血清IgG纯化是利用饱和硫酸铵沉淀法进行血清纯化，纯化步骤如下：A1、取5mL血清，加生理盐水5ml，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5mL，使成20％硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min；A2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白；A3、在上清液中再加饱和硫酸铵溶液7.5mL，使成50％硫酸铵溶液，充分混合，静置30min；A4、3000r/min离心20min，弃上清；A5、于沉淀中加5mL生理盐水，使之溶解，再加饱和硫酸铵2.5mL，使成33％硫酸铵溶液，充分混合后，静置30min；A6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白；重复步骤A5，2
‑
3次；A7、用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐
水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO
42
‑
：取3
‑
4mL透析液，加试剂1
‑
2滴，出现沉淀则表明有SO
42
‑
存在；透析直至无沉淀出现为止；A8、离心去沉淀，上清液即为粗提IgG，纯化后的血清冻存于
‑
20℃备用。4.根据权利要求1所述的一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述玻片凝集法测定兔抗维氏气单胞菌多克隆抗体效价时灭活的A.veronii调节浓度至1
×
108cfu/mL；将纯化的IgG使用PBS2倍的倍比稀释，即倍比为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64或1:128；将灭活菌液与稀释的IgG在干净的载玻片上1:1混合，置于湿盒中，37℃静置30min，显微镜观察菌体凝集情况；结果显示：玻片凝集法测定A.veronii多克隆抗体的抗体效价为1:32。5.根据权利要求1所述的一种维氏气单胞菌胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤2中所述Rosetta(DE3)
‑
pET
‑
b2m
‑
LamB表达菌株构建时将pET
‑
b2m
‑
LamB使用化学转化法转化入Rosetta(DE3)中；经PCR鉴定成功后，挑取Rosetta(DE3)
‑
pET
‑
b2m
‑
LamB单菌落分别按照1:50(V/V)的比例接种于10mLAmp
‑
LB液体培养基中，37℃、120r/min振荡培养过夜，同时按相同方式培养实验室保存的Rosetta(DE3)
‑
pET32(a)；培养好的菌液作为母液置于4℃中保存备用；所述LamB蛋白的诱导表达时Rosetta(DE3)
‑
pET
‑
b2m
‑
LamB和Rosetta(DE3)
‑
pET32(a)母液分别按照1:100(V/V)的比例接种于100mLAmp
‑
LB液体培养基中，37℃、120r/min振荡培养至菌液浓度为OD600＝0.6，分别加入IPTG至终浓度为1mmol/L，同时分别设置一组未加入IPTG的对照组，于37℃，诱导表达4h；所述SDS
‑
PAGE取上述两组的菌液各1mL，12,000g离心1min，弃去上清，沉淀用PBS洗涤一次后，加入40μL，20mmol/L的Tris
‑
HCl(pH＝8.0)重...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟振东，鄢林霞，黄凌远，徐婧，俞雨阳，熊权鑫，罗丹，何金利，
申请(专利权)人：成都里来科创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：