一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得。本发明专利技术筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了70℃下的酶半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加。本发明专利技术展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体扩展了相对稀少的乳果糖异构酶酶库，展示了重要的工业应用前景。的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。

技术介绍

[0002]乳果糖(4
‑
O
‑
β
‑
半乳糖苷
‑
D
‑
果糖)，是由一分子半乳糖和一分子果糖经β
‑
1,4糖苷键缩合而成的二糖。乳果糖因其对双歧杆菌增殖因子的作用，可用作食品添加剂添加在婴儿奶粉、酸奶中；乳果糖口服液可有效治疗高血氨疾病和慢性便秘，需求量巨大。乳果糖制备可分为化学法和生物法，传统的化学法制备乳果糖的过程中需要加入大量的化学试剂，对反应条件要求苛刻，因此生物法制备乳果糖成为最近的研究热点。
[0003]生物合成法是指利用酶或者含有该酶的细胞作为生物催化剂转化底物生成相关产物。生物合成法具备独特的优势：生物酶自身无毒，环境压力小；催化具有高立体选择性和区域选择性，适用于结构复杂物质的相互转化；反应条件温和，能耗负担小。目前，利用生物合成法异构化制备多种糖类化合物，已成为制糖工业绿色化的突破点。
[0004]生物法可分为β
‑
半乳糖苷酶法和纤维二糖差向异构酶法，β
‑
半乳糖苷酶法需要添加乳糖和果糖作为底物，副产物种类繁多，产物得率低(7.5～30％)，不适宜开展工业化。相比之下，纤维二糖差向异构酶(cellobiose 2
‑
epimerase，EC 5.1.3.11，简称CE) 能够直接利用乳糖为底物合成乳果糖，反应后只存在唯一副产物依匹乳糖，产物得率相较于β
‑
半乳糖苷酶更具优势。目前，已有Caldicellulosiruptor saccharolyticus CE (CsCE)、Caldicellulosiruptor obsidiansis CE(CoCE)、Dictyoglomus turgidum CE (DtCE)和Dictyoglomus thermophilum CE(DitCE)等酶具备合成乳果糖的能力。其中CsCE报道最多，使用最为广泛。
[0005]然而，CE仍然受到以下限制：高温有利于提高异构化反应速率、降低副产物依匹乳糖生成，而天然CE酶往往对长时间高温的耐受力较差；但各国药典乳果糖溶液中对依匹乳糖含量均有严格限制，因此合成乳果糖的反应中需要降低依匹乳糖含量。
[0006]蛋白质工程可对天然生物酶的不足进行针对性改造，以达到预期的优良特性。本专利技术通过开发新型纤维二糖差向异构酶，对其实施分子改造，获得高效制备乳果糖的生物催化剂，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体、编码基因、工程菌及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用，特别是突变体ChCE/K335Q，为乳果糖制备工艺提供一种绿色高效的生物制备方法。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得的；优选将第335位赖氨酸突变为谷氨酰胺
(K335Q)，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8 所示；或第271位缬氨酸变为亮氨酸(V271L)，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0010]本专利技术还涉及一种所述纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因，包含所述编码基因的重组载体，以及包含所述重组载体的重组基因工程菌；所述重组载体以pET28b 为载体，插入位点Xba I和Xho I，所述重组基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
[0011]本专利技术还提供一种所述纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/ChCE/K335Q)经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6
‑
8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50
‑
80℃、100
‑
200r/min条件下反应，反应液分离纯化，获得乳果糖。
[0012]优选，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL 的卡那霉素抗性的10mL LB液体培养基中，37℃培养8h；培养液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的100mL LB培养基中，在37℃，150 r/min的条件下培养OD
600
＝0.6
‑
0.8，添加终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导发酵12h，离心弃上清液，收集湿菌体。
[0013]优选，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌发酵培养的湿菌体按1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，工作1s间隔2s，破碎混合液在8000r/min 离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel
‑
NTA亲和层析柱 (Bio
‑
Scale Mini Profinity IMAC预装柱，40mm长
×
12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样(优选4个柱体积)，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器的信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为纯酶。
[0014]优选的，所述反应液分离纯化制备乳果糖的方法为：将反应液，以10000rpm离心10min，收取上清液，再以1.5mL/min的速率通过DOWEX MONOSPHERE 77阴离子交换树脂和DOWEX MONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋近于零，停止脱盐；收集富含乳果糖的洗脱液；洗脱液减压蒸馏浓缩至糖浓度约为85％，加入200目的一水乳糖粉作为晶种进行结晶，晶种添加量与溶液占比为0.002
‑
0.004％％(w/w)，再以6℃/h的速度降温冷却结晶出乳糖晶体，10000rpm 离心10min，得到乳果糖糖浆。
[0015]与现有技术相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得的。2.如权利要求1所述的纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位赖氨酸突变为谷氨酰胺；或第271位缬氨酸变为亮氨酸。3.一种权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因。4.一种包含权利要求3所述编码基因的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6
‑
8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50
‑
80℃、100
‑
200r/min条件下反应，获得乳果糖。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾东旭，柳志强，金利群，王番，余海，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：