具有乳酸耐受性提高的酵母及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种基因工程化的克鲁维酵母菌属的种的酵母细胞，该酵母细胞至少包含使编码转录因子SEQ ID No.2(特别是Haa1)的核酸序列失活或缺失的基因修饰。与亲本相比，根据本发明专利技术的基因工程化的酵母细胞具有乳酸耐受性、乳酸产量或它们的组合的提高。乳酸产量或它们的组合的提高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有乳酸耐受性提高的酵母及其用途


[0001]涉及具有乳酸耐受性提高的酵母及其用途的生物技术，特别是基因工程。

技术介绍

[0002]由可再生资源生产的有机酸正成为几个行业的有吸引力的分子。在能源工业中，生物乙醇和生物丁醇已经得到长期开发和商业化应用。乳酸和琥珀酸也是以生物方式生产的，并作为原料用在多种应用中，例如食品工业中的食品和饲料添加剂、个人护理生产中的温和溶剂应用以及生物基树脂生产中的生物聚合物合成。所有上述分子都是通过被称为发酵的众所周知的过程产生的。发酵过程最大的挑战是生产成本。
[0003]已经进行了几种降低生产成本的尝试。为了降低发酵原料(fermentation feedback)的成本，已经提议农业废物，例如来自制糖工业的甘蔗渣(bagasse)。来自甘蔗渣的纤维素可以物理分解和化学分解成可发酵的糖，以供细菌利用。但是，预处理过程中的多种杂质会对细菌产生抑制作用。例如，半纤维素分解释放的乙酸盐/酯(acetate)是众所周知的大多数微生物的抑制剂。此外，在甘蔗渣的储存过程中，一些细菌的污染所产生的非期望的乳酸也会影响发酵过程。
[0004]另一方面，在发酵过程中防止细胞损伤的问题的成本也很高昂。例如，它发生在弱酸(例如乳酸和琥珀酸)生产的情况下。在这些酸的发酵过程中，重要的是要中和已产生的乳酸并对产生的乳酸盐(lactate)脱盐，以防止降低pH值对细胞活动造成损害。在生物技术工艺中使用的强大细菌中，酵母因其健壮性(robustness)和对低pH值的耐受性而被广泛使用。尽管如此，pH值低于2.8，工程化的酵母菌株的乳酸产量下降。因此，赋予酵母更高的乳酸抗性将提高非中和条件下的乳酸生产力。
[0005]已经在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母中进行了几项研究，其中清楚地表明酵母细胞通过由HAA1基因编码的转录因子的调节而对酸作出响应。
[0006]杉山(Sugiyama)等人(应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology),2014,80,3488
–
3495)尝试过度表达编码转录因子的HAA1基因，以模拟其蛋白质Haa1p重新定位到核酸酶中，从而诱导弱酸适应机制，以期提高酿酒酵母中的乳酸抗性。本研究还发现，与亲本菌株相比，haa1缺失菌株(disruptant)引起了严重的乳酸敏感性。
[0007]田中(Tanaka)等人(应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology),2012,78,8161
–
8163)公开了关于HAA1在酿酒酵母中的过度表达可以提高乙酸耐受性的类似结果。
[0008]US9085781B2以及思文(Swinnen)等人(微生物细胞工厂(Microbial Cell Factories),2017,16:7,1
‑
15)试图诱导点突变来微调酿酒酵母中的HAA1表达；因此，与野生型等位基因相比，它导致了更高的乙酸抗性。
[0009]WO2016083397A1公开了HAA1及其旁系同源物(paralog)CUP2的组合以实现酵母(特别是酿酒酵母)中耐酸性的提高。这些复杂性主要导致了将这种方法用于商业化生产规
模中的障碍。
[0010]此外，在此研究领域，已经对酵母菌株(特别是酿酒酵母)进行了一些研究，以提高乳酸耐受性但不涉及HAA1基因。
[0011]US9994877B2公开了一种基因工程化的酵母细胞增加了SUL1、STR3、AAD10、MXR1、GRX8、MRK1、GRE1、HTX7、ERR1或它们的组合的活性。与其亲本细胞相比，获得的酵母菌株具有增加的耐酸性，并且有助于生产乳酸。
[0012]US9758564B2公开了一种抗酸酵母细胞，其降低了编码Fps1的多核苷酸的表达以增加乳酸抗性。
[0013]US10053714B2公开了一种耐酸基因工程化的酵母细胞，该酵母细胞包括以下基因修饰：增加催化磷脂酰肌醇(PI)和神经酰胺转化为肌醇磷酸神经酰胺(IPC)和二酰基甘油(DG)的酶的活性，或增加催化将双键引入脂肪酰基
‑
CoA的脂肪酰基位点的酶的活性，和/或降低催化从DG形成三酰基甘油(TG)的酶的活性或它们的组合，以及可选地降低外部线粒体NADH脱氢酶NDE1和/或NDE2的活性，NDE1和/或NDE2可以增加对具有1
‑
20个碳原子的有机酸(尤其是乳酸)的耐受性。
[0014]铃木(Suzuki等人)(生物科学与生物工程期刊(Journal of Bioscience and Bioengineering),2013,115,467
‑
474)报道了通过结合导致乳酸抗性的基因破坏来在酿酒酵母中构建抗酸酵母。本研究发现，94个基因缺失菌株体显示出对乳酸的抗性，并发现通过结合几个基因的破坏而进一步增强了乳酸抗性，导致高乳酸生产力而无需中和。
[0015]基于上述原因，本专利技术公开了一种简单的方法来提高其他非常规酵母的乳酸耐受性，特别是提高克鲁维酵母菌属的种(Kluyveromyces sp.)的乳酸耐受性，其中，缺失HAA1足以导致其乳酸耐受性、乳酸产量或它们的组合的提高。
[0016]本专利技术的改良酵母可用于广泛的方面，例如但不限于，通过使用含有任何酸性杂质的低成本原料的发酵过程，并进行发酵以产生具有高水平游离乳酸的发酵液。这些优点是成本效益(cost
‑
effectiveness)生产。

技术实现思路

[0017]本专利技术涉及一种基因工程化的克鲁维酵母菌属的种(Kluyveromyces sp.)的酵母细胞，该酵母细胞至少包含使编码氨基酸SEQ ID No.2(特别是Haa1)的核苷酸序列失活或缺失的基因修饰。
[0018]与亲本相比，根据本专利技术的基因工程化的酵母细胞具有乳酸耐受性、乳酸产量或它们的组合的提高。
附图说明
[0019]图1 pHAA1del2的结构，一种包含用于缺失来自菌株MYR2297和MYR2787的HAA1基因的盒(cassette)的质粒。
[0020]图2用于缺失来自菌株MYR2297和MYR2787的HAA1基因的过程示意图。
[0021]图3 MYR2297亲本细胞(MYR2297 HAA1)和携带有Δhaa1破坏(disruption)的MYR2297(MYR2297 Δhaa1)在CM减尿嘧啶的固体培养基(CM minus uracil solid medium)(补充0.5％(pH 2.7)、1.0％(pH 2.5)、1.5％(pH 2.4)、2.0％(pH 2.3)的乳酸或未补充乳
酸(pH 3.5))上、在30℃下孵育2天的生长性能。
[0022]图4 MYR2787亲本细胞(MYR2787 HAA1)、携带有Δhaa1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基因工程化的克鲁维酵母菌属的种(Kluyveromyces sp.)的酵母细胞，其中，所述酵母细胞至少包含使编码氨基酸SEQ ID No.2的核苷酸序列失活或缺失的基因修饰。2.根据权利要求1所述基因工程化的克鲁维酵母菌属的种的酵母细胞，其中，所述氨基酸SEQ ID No.2是酸反应性转录因子Haa1。3.根据权利要求1或2所述基因工程化的克鲁维酵母菌属的种的酵母细胞，其中，与亲本相比，所述基因修饰增加乳酸耐受性。4.根据前述权利要求的权利要求1或2所述基因工程化的克鲁维酵母菌属的种...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：PTT全球化学公共有限公司，
类型：发明
国别省市：