一种复合微球及其制备和在磷酸化肽吸附中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可重复使用的复合微球的制备方法及磷酸化肽吸附应用。具体是以环氧树脂微球为基质，利用环氧

【技术实现步骤摘要】
一种复合微球及其制备和在磷酸化肽吸附中的应用


[0001]本专利技术涉及一种可重复使用的复合微球的制备方法及磷酸化肽吸附应用。具体是以环氧树脂微球为基质，利用环氧
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胺开环反应将表面带有氨基的纳米金刚石键合在微球表面。因其表面含有氨基，可以与2,3,4
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三羟基苯甲醛发生氨醛缩合反应，将联苯三酚基团引入微球表面。以其作为配体螯合钛离子(Ti
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)，得到可以用作IMAC吸附剂的复合微球。

技术介绍

[0002]蛋白质的磷酸化是蛋白质翻译后修饰中常见的一种形式，它可以调节多种复杂的生物学过程如信号传导、分子识别和代谢等。然而，蛋白质磷酸化的异常会引发一些疾病的产生。因此，磷酸化多肽的分析对于疾病的治疗有着很重要的现实意义(文献1.Q.Sheng,et.al.“Synthesis of Al
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doping
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TiO
2 monodisperse microspheres and their application for phosphopeptides and glycopeptides enrichment”Talanta,2021,223,1
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8)。质谱技术因其灵敏度高、分析速度快等特点已被广泛用于磷酸化肽段的分析中。然而，由于非磷酸肽的干扰，未经预处理的磷酸肽丰度低，难以被检测到。所以在质谱分析前，从复杂生物样品中有效富集磷酸肽是必不可少的(文献2.J.Arrington,et.al.“Analytical challenges translating mass spectrometry
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based phosphoproteomics from discovery to clinical applications”Electrophoresis,2014,35,3430
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3440)。此前发展了很多用于磷酸化多肽分离富集的方法。例如，金属氧化物亲和色谱法，免疫亲和捕获法，固定化金属离子亲和色谱法和离子交换色谱法等。其中，固定化金属离子亲和色谱法因对磷酸肽独特的选择性和良好的富集能力得到了广泛的应用(文献3.许静静等.“翻译后修饰蛋白质组学分离方法的研究进展”色谱,2016,34,1199
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1205)。固定化金属离子亲和色谱法是利用固定在材料上的金属离子高选择性螯合带负电的磷酸根，从而实现对磷酸化肽段的富集(文献4.邓玉皎等.“磷酸化蛋白质组学在乳腺癌中的研究发展”医学新知,2020,30,449
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456)。
[0003]近年来发展了很多富集磷酸化肽的材料。例如，Qing等将一个能高效识别磷酸的单体
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对羧基苯基硫脲与多孔硅胶基质进行复合，制备了一种可以识别多磷酸化肽的共聚物(文献5.G.Qing,et.al.“Hydrogen bond based smart polymer for highly selective and tunable capture of multiply phosphorylated peptides”Nat.Commun.2017,10,461)。Zhang等通过水热法将乙烯基磷酸和葡萄糖合成一种碳质球材料，用于磷酸肽的富集(文献6.H.Zhang,et.al.“One
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step preparation of phosphate
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rich carbonaceous spheres via a hydrothermal approach for phosphopeptide analysis”Green Chem.2019,21,2052
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2060)。但这些材料均是一次性的，本专利技术中合成的复合微球材料选择性高且可重复使用。该复合材料中Ti
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与2,3,4
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三羟基苯甲醛之间的强作用力使得富集洗脱后Ti
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不被破坏，因此，该材料能被重复使用。

技术实现思路

[0004]本专利技术涉及一种可重复利用的复合微球的制备方法及磷酸化肽吸附应用。该材料以表面带有环氧基团的树脂微球为基质，通过环氧
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胺开环反应将带氨基化纳米金刚石引入微球表面。微球表面引入的氨基与2,3,4
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三羟基苯甲醛发生氨醛缩合反应，使其表面带有联苯三酚基团，此基团作为配体螯合Ti
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。制备的复合微球材料用作IMAC吸附剂，用于复杂样品中磷酸化肽的分离富集。该复合微球材料结构如下：
[0005][0006]该复合微球材料具体制备过程包括如下步骤：
[0007](1)制备表面带有氨基的微球：将50～100mg带氨基的纳米金刚石超声分散在20～30mL乙醇/乙二醇(1/2～2/1,体积比)混合溶液中，加入100～300mg环氧树脂微球。在50～80℃下，以100～200rpm的转速，机械搅拌4～10h，反应结束用10～50mL乙醇洗涤3～5次。
[0008](2)复合微球表面引入联苯三酚基团：将100～300mg上述步骤(1)中得到的表面带有氨基的微球分散在10～30mL浓度为1～3mg/mL的2,3,4
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三羟基苯甲醛的乙醇溶液中，60～80℃下，机械搅拌100～200rpm反应4～10h，反应结束用乙醇洗涤3～5次。将洗涤后的产物分散在20～30mL浓度为1～3mg/mL的硼氢化钠水溶液中，20～30℃下，在旋转孵育器中以20～40rpm的转速，反应4～10h，反应结束用水洗至中性。
[0009](3)复合微球表面引入钛离子：用20～30mL乙二醇
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水(1/4～1/2,体积比)溶液溶解硫酸钛，配制成浓度为1/5～1/2g/mL的溶液，加入上述产物中，以20～40rpm的速度孵育震荡12～24h，反应结束用水洗涤至中性，60～80℃真空干燥6～12h，得到复合微球。
[0010]所述复合微球可用于生物样品中磷酸肽的分离富集。
[0011]本专利技术具有如下优点：
[0012](1)制备的材料对磷酸肽的富集效率高，选择性能好。
[0013](2)材料可重复使用，绿色环保，有良好的应用前景。
附图说明
[0014]图1.实施例中复合微球的制备与使用示意图。
[0015]图2.实施例1中复合微球
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1的X
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射线光电子能谱图。
[0016]图3.实施例中复合微球的氦离子扫描电镜图。(a)为未修饰的环氧树脂微球；(b)为实施例1中的复合微球
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1；(c)为实施例2中的复合微球
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2；(d)为实施例3中的复合微球
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3。
[0017]图4.实施例中复合微球的氮气吸附脱附等温线图和孔径分布图。(a)和(b)分别为实施例1中的复合微球
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合微球，其是以环氧树脂微球为基质，利用环氧
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胺开环反应将表面带有氨基的纳米金刚石键合在微球表面；因氨基化纳米金刚石表面含有氨基，可以与2,3,4
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三羟基苯甲醛发生氨醛缩合反应，将联苯三酚基团引入微球表面，以其作为配体螯合钛离子(Ti
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)，得到可以用作固定化金属离子亲和色谱(IMAC)的复合微球。2.一种权利要求1所述复合微球的制备方法，其特征在于：表面带有氨基的纳米金刚石对环氧树脂微球进行氨基化处理；以2,3,4
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三羟基苯甲醛为修饰剂引入联苯三酚配体与钛离子进行螯合。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：该复合微球可按如下步骤操作，1)制备表面带有氨基的微球：将50～100mg表面带氨基的纳米金刚石(氨基化纳米金刚石，粒径2～10nm)超声分散在20～30mL乙醇/乙二醇(1/2～2/1,体积比)混合溶液中，加入100～300mg环氧树脂微球(粒径2.7～3.0μm)；在50～80℃下，以100～200rpm的转速，机械搅拌4～10h，反应结束用10～50mL乙醇洗涤3～5次；2)复合微球表面引入联苯三酚基团：将100～30...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧俊杰，孙传盛，贾世聪，叶明亮，
申请(专利权)人：威高集团有限公司，
类型：发明
国别省市：