一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16SrRNA基因的测序方法技术

本发明专利技术专利公开了一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其方法包括如下步骤：提取临床样本中的总基因组、总基因组末端去磷酸化封闭、通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列、选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴、并连接测序接头、根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种；本发明专利技术专利使用了稳定16S rRNA的V2

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法


[0001]本专利技术专利涉及微生物检测
，具体为一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法。

技术介绍

[0002]16S rDNA主要编码细菌核糖体16S rRNA，全长约1500bp，因其部分片段在进化过程中的保守性而作为细菌进化的生物钟，亦有“细菌化石”之称，16S rDNA的序列中包含9个可变区和11个保守区，通过检测高变区序列来识别细菌是目前测序的主要手段，而可变区序列则因种属而异，且变异程度与细菌的系统发生位置(分类学上的种、属、科等)密切相关，因此，使用16SrRNA基因序列分析，可快速对细菌进行鉴定分类，纳米孔测序基于其读取长和结果快速输出的特点已逐渐应用在临床检测领域，目前也有商品化的16SrRNA基因建库试剂盒用于纳米孔测序。
[0003]然而，读取16S rRNA全长基因序列并不能完全确认细菌的种属，因此需要获取16S rRNA基因延伸的序列提高细菌检测鉴别的准确性，除此以外，通过检测16S rRNA基因延伸序列还能检测细菌的耐药基因，为临床用药提供更全面的用药指导建议。
[0004]因此，需要开发一种基于纳米孔测序平台检测细菌病原体的新方法。
[0005]专利技术专利内容
[0006]本专利技术专利的目的在于提供一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，为实现上述目的，本专利技术专利提供如下技术方案：一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其制备方法包括如下步骤：
[0007]S1，提取临床样本中的总基因组；
[0008]S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
[0009]S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
[0010]S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
[0011]S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
[0012]优选的，所述总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。
[0013]优选的，所述临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。
[0014]优选的，所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
[0015]优选的，所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据酶切反应体系，将RNP和样品基因组按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的酶切程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品A。
[0016]优选的，所述选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴的方法中，包括：所述样品基
因组两端去磷酸化被封闭无法连接dATP而选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，根据添加A黏性末端尾巴反应体系，将所述样品A、dATP、Taq酶按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的添加A黏性末端尾巴程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品B。
[0017]优选的，所述连接测序接头的方法中，包括：根据连接测序接头反应体系，将所述样品B、AMX、快速T4连接酶、LNB、无酶水按体系震荡混匀，瞬时离心，室温孵育。
[0018]优选的，所述测序数据与基因数据库进行序列对比，依据比对结果获得检测样品中病原细菌微生物信息。
[0019]优选的，所述细菌通用sgRNA为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、玫瑰单胞菌、人型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、淋病奈瑟球菌。
[0020]与现有技术相比，本专利技术专利的有益效果如下：
[0021]1、本专利技术专利使用了稳定16S rRNA的V2
‑
V3保守基因进行靶向富集，以V2
‑
V3为测序起点，检测获得16S rRNA两端基因覆盖率更高，检测范围更广，分类结果更可信；
[0022]2、本专利技术特异性靶向细菌16S rRNA基因建库，有效避免了宿主基因组的干扰，降低背景宿主的人源比例，提高病原体检测灵敏度和检出效率，缩短检测时间，提高纳米孔检测效率；
[0023]3、本专利技术所述方法对病原细菌微生物的鉴定具有无需培养、鉴定覆盖病原细菌微生物范围广、检测速度快、灵敏度高、准确率高等优势，能够一次快速地从样品种检测病原细菌微生物。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为本专利技术的实验流程图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术专利中的实施例，对本专利技术专利实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术专利一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术专利中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术专利保护的范围。
[0027]一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其制备方法包括如下步骤：
[0028]S1，提取临床样本中的总基因组；
[0029]S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
[0030]S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
[0031]S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
[0032]S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
[0033]具体的，总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将
磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。
[0034]具体的，临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。
[0035]具体的，通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
[0036]具体的，通用sgRNA靶向酶切方法包括根据酶切反应体系，将RNP和样品基因组按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的酶切程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品A。
[0037]具体的，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴的方法中，包括：样品基因组两端去磷酸化被封本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：S1，提取临床样本中的总基因组；S2，总基因组末端去磷酸化封闭；S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。5.根据权利要求2所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉辉，周家健，张卉，孙航，付钰，舒博文，杨德龙，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：