一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，包括以下操作步骤：步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞；步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理；步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验。本技术转座酶原位激活产生片段，分辨率高，背景信号低，信噪比高；步骤简单，省去了超声破碎和免疫共沉淀，节省了时间；将转座体产生的片段与测序接头整合，进行了pcr富集；程序高度灵敏，需要的起始材料量较少。需要的起始材料量较少。需要的起始材料量较少。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法


[0001]本专利技术涉及细菌基因检测
，具体为一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法。

技术介绍

[0002]目前研究中的大多数细菌，其本身的基因序列并没有被测通或者在测序后并没有对其序列进行注释，即便序列有注释，细菌内许多蛋白亦会被注释成假设蛋白；细菌上的质粒亦是近年来的研究的关注点之一，临床菌中含有很多质粒，质粒上的许多蛋白会被注释成假设蛋白，使得它们的功能并不清楚。有的假设蛋白会被注释成转录因子，其转录对象未知。同一个耐药基因在不同的临床耐药细菌中的表达量并不一致且相差较大，因此研究该耐药基因的转录调控，是研究临床耐药菌高耐药性机制的有效途径之一。临床上的许多细菌的耐药表型、耐药基因以及耐药机制并不能完全被人们所发现。近年来，产生耐药性的原因有很多，主要是取决于染色体编码机制，如外排泵的过表达和核糖体的保护。由于目前对细菌的染色体的基因序列或是质粒上的基因序列注释并不完善，许多蛋白会被注释成假设蛋白，再者，耐药基因的表达调控，或者是细菌本身携带有的外排泵调控仍处于一个探索研究的阶段，这使得人们在现有的分子机制水平上无法对这三者之间的关系有一个很好的解释。而对部分在注释上可能是转录因子的蛋白所可能调控的基因进行研究，这可能有助于人们去研究耐药基因或某些表型相关基因的被调控情况。
[0003]早在2007年，染色质免疫共沉淀（ChIP
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seq）技术就作为新一代测序的早期应用之一被发表。ChIP是一种基于抗体的技术，主要是在活细胞上进行操作，可用来选择性地使特异性 DNA 结合蛋白及其 DNA 靶标富集，将目的片段纯化后进行检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息，常被用于检测某种特异蛋白或某种特异蛋白修饰在某个基因组区域的相对丰度。ChIP可用来研究某种特殊的蛋白
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DNA 相互作用、多种蛋白
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DNA 相互作用或全基因组或部分基因内的相互作用。但是ChIP
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seq技术在实验操作中存在着实验步骤繁琐、实验周期长、实验所需起始细胞量大、可重复性差、对实验操作要求较高等问题。为了能够更好地获得数据，弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士早期在Nature Communication上发布了染色质靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术，随后便在世界范围内进行了广泛的应用。
[0004]染色质靶向切割和标签化（CUT&Tag）技术是一种基于标记的表观基因组分析方法，其中特定的染色质蛋白被其特定的抗体原位识别，并且与pAG
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Tn5转座酶结合。利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下来的DNA片段进行标签化，再通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质
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DNA的相互作用。
[0005]目前，CUT&Tag技术主要应用于组蛋白类、转录因子类、全基因组范围内蛋白以及实验室模式生物（人、动物、植物、微生物样本），国内外暂无对CUT&Tag技术对细菌的研究报导。其中很大一个原因是在CUT&Tag技术中需要用到抗体孵育来使得带有目的DNA片段的特异性染色质附合物富集沉淀，而在该步骤中需要用到抗体，目前针对细菌中各个蛋白所生产的商业化抗体较少，由于成本问题，人们通常不会为了研究一个细菌而将其中所有蛋白
质纯化出来再进行抗体制作，这就阻碍了该项技术在细菌中的普及应用。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术方案的不足，本专利技术提供一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，能有效的解决
技术介绍
提出的问题。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，包括以下操作步骤：步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞，具体包括以下工序：DNA制备：用KOD酶与含有GFP荧光基因的模板进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得GFP荧光基因片段，同时，用KOD酶将设计好的含有HIS标签以及目的蛋白所对应基因序列的引物与相应的菌株进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得目的蛋白所对应基因，最后用TIANGEN质粒小提试剂盒对细菌进行质粒抽提；重组反应：计算获取重组反应所需DNA量，于冰上配制一定组分的反应体系，反应体系成分包括线性化载体、插入片段、5
×
CEⅡBuffer、Exnase
ꢀⅡ
、ddH2O，接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，在50℃条件下反应50分钟，并降至4℃或立即置于冰上冷却处理；重组产物转化：在冰上解冻克隆感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，在冰上静置30分钟，然后在42℃水浴中热激1分钟后，立即置于冰上冷却2~3分钟，接着加入900μLLB肉汤培养基，在37℃条件下以180rpm摇菌1小时，再以5000rpm离心处理5分钟，弃掉800μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，最后在37℃培养箱中倒置培养12~16小时；重组产物鉴定：过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆；步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理，具体包括以下工序：诱导蛋白表达：调制菌悬液：挑单菌到装有4mL LB肉汤的试管中，并加入40μL 10%阿拉伯糖到已接种单菌的肉汤中，在37℃条件下以180 rpm摇床中摇4小时，使菌量达到1
×
108CFU/mL；交联：从上述4mL菌液中吸取1mL到2.0EP管中，再在菌液中加入1%甲醛溶液，并放置于37℃在以180rpm摇床中摇10min进行交联，随后取出，加入125mM甘氨酸终止交联；步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验，具体包括以下工序：Buffer溶液配制：按照说明配制相应的Buffer溶液，现配现用，Buffer溶液包括Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig
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wash Buffer溶液和Dig
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300 Buffer溶液；ConA Beads处理：取一支8联管，每个样本加入100μL Binding Buffer溶液，使用移液器充分重悬ConA Beads，取出10μL ConA Beads至上一步的Binding Buffer溶液中，混合均匀并置于磁力架上，待溶液澄清后，弃尽上清，再将8联管从磁力架上取下，加入100μL Binding Buffer溶液，用移液器轻轻吹打混匀，接着将8联管置于磁力架上，待液体澄清后，弃尽上清，加入10μL Binding Buffer溶液重悬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细菌的CUT&Tag测序建库方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤S1，载体构建，将荧光基因克隆到中拷贝质粒中，设计酶切位点利用一步克隆法进行酶切，从而构建一个含有荧光基因、HIS标签、目的蛋白所对应基因序列的质粒载体，并将该质粒转化到受测菌株的感受态细胞，具体包括以下工序：DNA制备：用KOD酶与含有GFP荧光基因的模板进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得GFP荧光基因片段，同时，用KOD酶将设计好的含有HIS标签以及目的蛋白所对应基因序列的引物与相应的菌株进行PCR扩增，并进行胶回收处理，获得目的蛋白所对应基因，最后用TIANGEN质粒小提试剂盒对细菌进行质粒抽提；重组反应：计算获取重组反应所需DNA量，于冰上配制一定组分的反应体系，反应体系成分包括线性化载体、插入片段、5
×
CEⅡBuffer、ExnaseⅡ、ddH2O，接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，在50℃条件下反应50分钟，并降至4℃或立即置于冰上冷却处理；重组产物转化：在冰上解冻克隆感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，在冰上静置30分钟，然后在42℃水浴中热激1分钟后，立即置于冰上冷却2～3分钟，接着加入900μLLB肉汤培养基，在37℃条件下以180rpm摇菌1小时，再以5000rpm离心处理5分钟，弃掉800μL上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀，最后在37℃培养箱中倒置培养12～16小时；重组产物鉴定：过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆；步骤S2，利用CUT&Tag技术起始样品处理，具体包括以下工序：诱导蛋白表达：调制菌悬液：挑单菌到装有4mL LB肉汤的试管中，并加入40μL 10％阿拉伯糖到已接种单菌的肉汤中，在37℃条件下以180rpm摇床中摇4小时，使菌量达到1
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108CFU/mL；交联：从上述4mL菌液中吸取1mL到2.0EP管中，再在菌液中加入1％甲醛溶液，并放置于37℃在以180rpm摇床中摇10min进行交联，随后取出，加入125mM甘氨酸终止交联；步骤S3，利用CUT&Tag技术试剂盒进行试验，具体包括以下工序：Buffer溶液配制：按照说明配制相应的Buffer溶液，现配现用，Buffer溶液包括Binding Buffer溶液、Wash Buffer溶液、Antibody Buffer溶液、Dig
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wash Buffe...

【专利技术属性】
技术研发人员：连新磊，温嘉瑜，李梦圆，廖晓萍，孙坚，刘雅红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：