本发明专利技术提供一种RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，包括如下步骤：步骤1)：用高碘酸钠溶液对RNA样品进行处理；步骤2)：将步骤1)处理后的RNA样品用Endonuclease V进行酶切反应；步骤3)：将步骤1)处理后的RNA样品和步骤2)酶切反应后的RNA样品分别进行文库构建；步骤4)：对步骤3)得到的两组文库测序，比较两组测序结果，确定富集reads，回溯富集reads的酶切位点找到突变的位点，即找到次黄嘌呤修饰位点。其高特异性、高灵敏度，操作简便。操作简便。操作简便。
【技术实现步骤摘要】
RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法
[0001]本专利技术专利涉及核酸化学生物学领域，尤其是指一种RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法。
技术介绍
[0002]基因是主要的遗传物质，基因序列中包含生长、衰老、凋亡等过程的全部信息。表观遗传学研究的是非基因序列改变导致基因表达水平变化，如核酸甲基化、RNA修饰和染色质构象变化等。人们慢慢认识到了表观遗传学的重要性。目前在蛋白质编码区和非编码RNA上已鉴定出170多种RNA的化学修饰，它们对生命体的正常生长发育过程有着重要影响，并且这些修饰需要正确地定位，异常的RNA修饰将会导致基因表达的失调，甚至导致肿瘤发生。
[0003]RNA编辑是一种常见的RNA修饰，具有多种功能，涉及氨基酸改变，可变剪接，RNA干扰(RNAi)和microRNA变异介导的翻译抑制等。腺苷到肌苷的修饰是从蠕虫到人类的后生动物中发现的一类丰富的RNA编辑。是由作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)催化RNA的双链区域中腺苷水解为肌苷。脊椎动物的正常发育和无脊椎动物的正常行为都需要ADAR的活性。此外，从A到I的RNA编辑可能与多种神经系统疾病有关。在人类转录组的mRNA的编码区，内含子和非翻译区中，已经从生物信息学方面鉴定或预测了许多从A到I的编辑位点。在非翻译区域内，大多数A
‑
to
‑
I编辑位点都位于Alu重复元件中，这是ADAR的良好底物。
[0004]创建准确的A
‑
to
‑
I RNA编辑图谱对于我们了解I的生物学功能，并将其作为信号疾病诊断有着重要作用。现有的I检测方法有生物信息学计算统计的方法，还有化学方法比如ICE
‑
seq等，但是这些方法都有不足之处。
[0005]因此，研发一种高特异性、高灵敏度的检测RNA中I的方法显得很有必要。
技术实现思路
[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本专利技术提供一种RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1)：用高碘酸钠溶液对RNA样品进行处理；
[0008]步骤2)：将步骤1)处理后的RNA样品用Endonuclease V进行酶切反应；
[0009]步骤3)：将步骤1)处理后的RNA样品和步骤2)酶切反应后的RNA样品分别进行文库构建；
[0010]步骤4)：对步骤3)得到的两组文库测序，比较两组测序结果，确定富集片段，回溯富集片段的酶切位点找到突变的位点，即找到次黄嘌呤修饰位点。
[0011]根据本专利技术的技术方案，所述步骤1)中，高碘酸钠溶液的浓度为10mM。
[0012]根据本专利技术的技术方案，所述步骤1)中，用高碘酸钠溶液对RNA样品进行处理，具体为：将RNA样品与10mM的高碘酸钠溶液在0℃下避光反应30～50分钟。
[0013]根据本专利技术的技术方案，所述步骤2)中，所述酶切反应温度控制为37℃，时间控制
为0.5～1h。
[0014]根据本专利技术的技术方案，所述步骤3)中，所述文库构建包括：步骤
①
：RNA样品的3
’
末端与RNA接头连接；步骤
②
：逆转录成cDNA；步骤
③
：将cDNA的5
’
末端与DNA接头连接；步骤
④
：pcr扩增以及纯化。
[0015]根据本专利技术的技术方案，所述步骤
①
包括：向样品中加入所述RNA接头、T4 RNA Ligase Reaction Buffer、50％PEG 8000、DTT、T4 RNA ligase 2truncated KQ，在25℃反应2小时，然后在16℃下反应12小时；其中，RNA接头的核苷酸序列为：5
’‑
rAPP
‑
AGATCGGAAGAGCGTCGTG
‑3’
SpC3(序列表中SEQ ID NO:1所示)，其中，rA表示腺嘌呤核糖，pp为两个磷酸根，SpC3表示间臂。
[0016]根据本专利技术的技术方案，所述步骤
②
包括：向样品加入RT primer，放进PCR仪中在75℃下加热2分钟，然后转移至冰上放置2分钟，加入RNase inhibitor、First Strand Buffer、DTT、dNTPmix、SuperScript III，依次在25℃下反应3分钟、在42℃下反应10分钟、在52℃下反应40分钟，其中，RT primer的核苷酸序列为：ACACGACGCTCTTCCGATCT(序列表中SEQ ID NO:2所示)。
[0017]根据本专利技术的技术方案，所述步骤
③
包括：向cDNA中加入所述DNA接头及DMSO并用移液器吹打混匀，在75℃下加热2分钟后立即转移至冰上放置2分钟，然后向体系里加入50％PEG8000、RNA ligation buffer、ATP和T4 RNA Ligase 1，置于PCR仪在25℃下反应12小时；其中，DNA接头的核苷酸序列为：
[0018]5’‑
Phos
‑
NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG
‑3’
SpC3(序列表中SEQ ID NO:3所示)，其中，Phos表示磷酸基团，SpC3表示间臂。
[0019]根据本专利技术的技术方案，所述步骤
④
中，pcr扩增所使用的正向引物和反向引物为购自NEB公司，pcr扩增所使用的正向引物商品名为NEB universal primer；pcr扩增所使用的反向引物商品名为NEB index primer。
[0020]pcr扩增所使用的正向引物序列为：
[0021]AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T；
[0022]pcr扩增所使用的反向引物序列为：
[0023]CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
‑
s
‑
T。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：本专利技术提供一种RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其高特异性、高灵敏度，操作简便。
附图说明
[0025]图1为本专利技术中RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法的流程示意图；
[0026]图2是测序结果的初步统计；
[0027]图3是挑选一段区域观察统计结果中位点的特征。
具体实施方式
[0028]下面将结合实施例和对比例对本专利技术的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例和对比例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)：用高碘酸钠溶液对RNA样品进行处理；步骤2)：将步骤1)处理后的RNA样品用Endonuclease V进行酶切反应；步骤3)：将步骤1)处理后的RNA样品和步骤2)酶切反应后的RNA样品分别进行文库构建；步骤4)：对步骤3)得到的两组文库测序，比较两组测序结果，确定富集片断，回溯富集片断的酶切位点找到突变的位点，即找到次黄嘌呤修饰位点。2.根据权利要求1所述的RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，高碘酸钠溶液的浓度为10mM。3.根据权利要求2所述的RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，用高碘酸钠溶液对RNA样品进行处理，具体为：将RNA样品与10mM的高碘酸钠溶液在0℃下避光反应30～50分钟。4.根据权利要求1所述的RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述酶切反应温度控制为37℃，时间控制为0.5～1h。5.根据权利要求1所述的RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述文库构建包括：步骤
①
：RNA样品的3
’
末端与RNA接头连接；步骤
②
：逆转录成cDNA；步骤
③
：将cDNA的5
’
末端与DNA接头连接；步骤
④
：pcr扩增以及纯化。6.根据权利要求5所述的RNA中次黄嘌呤的高通量测序检测方法，其特征在于，所述步骤
①
包括：向样品中加入所述RNA接头、T4 RNA ...
【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，危琦，韩少卿，袁可欣，翁小成，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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