一种诱导培养基及利用该诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法技术

本申请涉及蛋白表达的技术领域，具体公开了一种诱导培养基及利用该诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法。本申请提供的诱导培养基包括以下浓度的组分：胰蛋白胨35

【技术实现步骤摘要】
一种诱导培养基及利用该诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法


[0001]本申请涉及蛋白表达的
，具体涉及一种诱导培养基及利用该诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法。

技术介绍

[0002]结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的慢性传染性疾病，它是一种由单一致病菌引起死亡最多的疾病。结核病严重威胁了人类健康，是我国重点控制的重大传染性疾病之一，也是全球关注的卫生问题和社会问题。由于缺乏足够的检测工具，再加上结核病的严重程度，使得对结核菌的快速诊断至关重要。
[0003]目前，研究人员一直在关注开发一种新的使用抗体的诊断方法，从而可以快速和准确地诊断感染的病原体，如免疫层析检测方法。但是，抗体由于其对所需抗原的特异性和亲和力，因此，该检测方法需要寻找理想的抗原作为此项研究的基础。
[0004]MPT64是结核分枝杆菌(MTB)的主要分泌蛋白之一，分子量约为24kDa，它是一种特异性蛋白，可区分结核分枝杆菌复合物与结核分枝杆菌以外的分枝杆菌，以上两组分枝杆菌都能够表现出肺部感染的体征和症状。因此，制备高表达的MPT64重组蛋白，并利用其抗原特异性，有利于快速诊断结核病。

技术实现思路

[0005]为了提供一种MPT64蛋白的诱导表达方法，同时能够有效提高MPT64重组蛋白的产量，本申请提供一种诱导培养基及利用该诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法。
[0006]第一方面，本申请提供一种诱导培养基，采用如下的技术方案：一种诱导培养基，包括以下浓度的组分：胰蛋白胨35
‑
45mg/mL；酵母提取物18
‑
24mg/mL；氯化钠32
‑
47mg/mL；甘油25
‑
35mg/mL；诱导剂0.4
‑
0.8mg/mL；琥珀酸二辛酯磺酸酯钠2
‑
8mg/mL；所述诱导剂选自鼠李糖、阿拉伯糖、乳糖中的一种或多种。
[0007]本申请利用上述提供的诱导培养基用于MPT64蛋白的诱导表达方法中，能够有效提高MPT64重组蛋白的产量。MPT64蛋白的诱导表达方法中宿主细胞为大肠杆菌，大肠杆菌培养过程中最常使用的碳源物质为葡萄糖，但是培养基中葡萄糖在代谢过程中会产生乙酸和其他短链酸类副产物，这些副产物会降低RNA、DNA、蛋白质以及酯类的合成速率，从而使得宿主细胞的生长密度以及重组蛋白的产量降低。因此，本申请在诱导培养基中使用酵母提取物作为碳源，避免了乙酸的形成和蛋白的降解，从而可以增加细菌的生长密度，有利于提高重组蛋白的产量。
[0008]琥珀酸二辛酯磺酸酯钠是一种阴离子型表面活性剂，常用作香波、清洁剂及牙膏等的乳化剂和洗涤剂，无毒性。本申请发现将琥珀酸二辛酯磺酸酯钠作为诱导培养基的组分，能够进一步提高重组蛋白的产量。
[0009]相比于传统的诱导剂IPTG，本申请使用较为廉价的鼠李糖、阿拉伯糖、乳糖作为诱
导剂，不仅降低了培养基的成本，而且替换了有毒物质IPTG的使用，更适合于医药领域的应用。同时，经过试验分析可知，相比于IPTG作为诱导剂，本申请选择使用鼠李糖、阿拉伯糖、乳糖中的一种或多种，能够明显提高MPT64蛋白的产量。
[0010]优选地，所述诱导剂为鼠李糖和阿拉伯糖；所述鼠李糖和所述阿拉伯糖的浓度比为5：(0.8
‑
1.3)。
[0011]在一个具体的实施方案中，所述鼠李糖和所述阿拉伯糖的浓度比可以为5：0.8、5：1、5：1.3。
[0012]在一些具体的实施方案中，所述鼠李糖和所述阿拉伯糖的浓度比还可以为5：(0.8
‑
1)、5：(1
‑
1.3)。
[0013]经过试验分析可知，当控制诱导剂中鼠李糖和阿拉伯糖的浓度比在上述范围内时，能够进一步提高MPT64重组蛋白的产量。因此，本申请将诱导剂中鼠李糖和阿拉伯糖的浓度比控制在上述范围内。
[0014]第二方面，本申请提供了上述诱导培养基在蛋白诱导表达领域的应用。
[0015]第三方面，本申请提供了利用上述诱导培养基对MPT64蛋白进行诱导表达的方法，具体包括以下步骤：S1：根据所述MPT64蛋白的基因序列，设计引物，并以所述MPT64蛋白的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到所述MPT64蛋白的扩增片段；S2：将所述MPT64蛋白的扩增片段插入到表达载体中，得到重组质粒；S3：将所述重组质粒转化至宿主细胞中，筛选获得工程菌；S4：挑取所述工程菌的单菌落，接种于含抗生素的液体培养基中，培养之后，按接种比例接种到所述诱导培养基中，进行诱导表达，然后离心收集菌体、并纯化，获得MPT64重组蛋白。
[0016]本申请在诱导表达MPT64蛋白的方法中，经过基因扩增、制备重组质粒、并转化至宿主细胞中，筛选获得工程菌；然后利用诱导培养基对工程菌进行发酵培养，完成对MPT64蛋白的诱导表达。本申请提供的方法中，当宿主细胞的光密度值达到最佳时间，将工程菌接种至诱导培养基中，诱导培养基中的诱导剂可以自动诱导MPT64蛋白进行表达，在此过程中，无需监控细胞的生长状态以及手动添加诱导剂，极大方便了实验室操作，能够满足工业化生产。同时，本申请提供的诱导培养基与其他方法相比，能够有效提高重组蛋白的产量。
[0017]优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0018]进一步地，所述表达载体为pET系列载体。
[0019]由于大肠杆菌在廉价的培养基底物上能够快速生长，并易于扩大规模，作为异源蛋白的宿主细胞系统应用较为广泛，因此，本申请选择使用大肠杆菌作为宿主细胞。相应的，本申请选择合适的pET系列表达载体，与宿主细胞大肠杆菌配合使用，有利于MPT64蛋白的准确表达。
[0020]优选地，所述接种时的光密度OD
600
值为0.4
‑
0.8。
[0021]在一个具体的实施方案中，所述接种时的光密度OD
600
值可以为0.4、0.6、0.8。
[0022]在一些具体的实施方案中，所述接种时的光密度OD
600
值还可以为0.4
‑
0.6、0.6
‑
0.8。
[0023]宿主细胞的光密度与宿主细胞的生物量水平有关，因此需要在合适的光密度值，
对蛋白进行诱导表达。经过试验分析可知，当控制接种时的光密度OD
600
值在上述范围内时，能够进一步提高MPT64重组蛋白的产量。因此，本申请将光密度OD
600
值控制在上述范围内。
[0024]优选地，所述接种比例为(4
‑
8)：1000。
[0025]优选地，所述抗生素为卡那霉素。
[0026]进一步地，所述含抗生素的液体培养基中所述抗生素的浓度为20
‑
30μg/mL。
[0027]在一个具体的实施方案中，所述含抗生素的液体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导培养基，其特征在于，包括以下浓度的组分：胰蛋白胨35
‑
45mg/mL；酵母提取物18
‑
24mg/mL；氯化钠32
‑
47mg/mL；甘油25
‑
35mg/mL；诱导剂0.4
‑
0.8mg/mL；琥珀酸二辛酯磺酸酯钠2
‑
8mg/mL；所述诱导剂选自鼠李糖、阿拉伯糖、乳糖中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述诱导剂为鼠李糖和阿拉伯糖；所述鼠李糖和所述阿拉伯糖的浓度比为5：（0.8
‑
1.3）。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的诱导培养基在蛋白诱导表达领域的应用。4.一种MPT64蛋白在宿主细胞中的诱导表达方法，其特征在于，利用权利要求1
‑
2中任一项所述的诱导培养基对所述MPT64蛋白进行诱导表达。5.根据权利要求4所述的MPT64蛋白在宿主细胞中的诱导表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1：根据所述MPT64蛋白的基因序列，设计引物，并以所述MPT64蛋白的基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍波，董晓宁，沈晨光，蒋宇珊，尹美移，吴智广，李超辉，
申请(专利权)人：天津鸿宇泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：