内含肽MtuRecA突变体及其在生产谷胱甘肽GSH中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种内含肽Mtu RecA突变体，来源于Mycobacterium tuberculosis的RecA蛋白，其序列如SEQ ID No.3所示，编码DNA如SEQ ID No.4所示，并利用此内含肽构建了pET28a

【技术实现步骤摘要】
内含肽Mtu RecA突变体及其在生产谷胱甘肽GSH中的应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程
，特别涉及一种内含肽Mtu RecA突变体，可应用于谷胱甘肽GSH的生产。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(glutathione，r
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glutamyl cysteingl glycine，GSH)是一种含γ
‑
酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，易与某些药物、毒素等结合，使其具有整合解毒作用。谷胱甘肽不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品中广泛应用，谷胱甘肽能清除体内自由基，具有抗氧化的功能，除此之外还能帮助保持正常的免疫系统的功能。因此谷胱甘肽GSH具有重要的市场应用价值。但是，目前关于谷胱甘肽的工业化合成主要依赖于化学合成，这种合成方法副产物多、产率低、污染大、成本高，难以符合“碳中和”的时代需求。生物合成可以有效解决化学合成的缺陷，具有产率高、成本低和节能环保等优点。但对于复杂结构的谷胱甘肽GSH，仍然没有高效的合成途径。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种内含肽Mtu RecA突变体，并将其应用于谷胱甘肽GSH的表达分离纯化。
[0004]为了达到上述目的，所采取的技术解决方案如下：
[0005]一种内含肽Mtu RecA突变体，来源于Mycobacterium tuberculosis的RecA蛋白(Sequence ID:CFE66777.1)，截取93
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186和488
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531两段氨基酸序列，组合成融合蛋白，并将第一位半胱氨酸替换成丙氨酸，在C末端加上一个天冬酰胺，突变后的内含肽Mtu RecA突变体具体氨基酸序列见SEQ ID No.3，编码DNA序列可以是序列表中SEQ ID No.4所示的序列，或者编码序列表中SEQ ID No.3蛋白质序列的多核苷酸序列。
[0006]本专利技术还公开了上述的内含肽Mtu RecA突变体在生产谷胱甘肽GSH中的应用。
[0007]本专利技术还公开了一种内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白，其序列如SEQ ID No.7所示。
[0008]上述的内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白的编码DNA，其序列可以是序列表中SEQ ID No.8所示的序列，或者为编码序列表中SEQ ID No.7蛋白质序列的多核苷酸序列。
[0009]本专利技术还公开了一种pET28a
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内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH表达质粒，表达上述的内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白。
[0010]上述的内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白的原核表达载体。
[0011]优选的，所述原核表达载体为将上述的pET28a
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内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌而成。
[0012]本专利技术还公开了一种谷胱甘肽GSH的生产方法，其特征在于其步骤包括：
[0013](1)构建pET28a
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内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH表达质粒；
[0014](2)将pET28a
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内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌，选出阳性克隆；
[0015](3)培养阳性克隆，诱导谷胱甘肽GSH的表达；
[0016](4)分离纯化谷胱甘肽GSH。本专利技术对于现有技术的优点为：
[0017]本专利技术公开了一种内含肽Mtu RecA突变体，并用该内含肽与谷胱甘肽GSH进行融合表达，这种表达方式具有表达量高、纯化简单的优点，可以大幅降低谷胱甘肽GSH的生产成本。与传统内含肽Mtu RecA相比，本专利技术的内含肽Mtu RecA突变体能明显提高谷胱甘肽GSH的产量和纯度。
附图说明
[0018]图1：传统内含肽Mtu RecA与内含肽Mtu RecA突变体序列比对结果，图中未显示内含肽Mtu RecA突变体C端的天冬酰胺。
[0019]图2：传统内含肽Mtu RecA及内含肽Mtu RecA突变体与GSH融合蛋白诱导表达及纯化结果。
[0020]图3：HPLC检测传统内含肽Mtu RecA切割释放GSH效果。
[0021]图4：HPLC检测内含肽Mtu RecA突变体切割释放GSH效果。
具体实施方式
[0022]下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本专利技术的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]实施例1内含肽Mtu RecA突变体的设计
[0024]根据内含肽序列的比对和搜索，从Mycobacterium tuberculosis的RecA蛋白(Sequence ID:CFE66777.1)中，截取第93
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531氨基酸序列。再根据微小内含肽的氨基酸序列比对，去掉187
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487中间的氨基酸序列，最终与传统内含肽Mtu RecA的比对结果见图1。传统内含肽Mtu RecA的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，DNA序列见SEQ ID NO.2。此外，我们将截断的Mtu RecA内含肽的N端第一个半胱氨酸替换成丙氨酸，去掉内含肽变体的N端自切割活性；在内含肽的C端加上一个天冬酰胺，激活内含肽C末端的自切割活性。最终的Mtu RecA内含肽变体的氨基酸序列见SEQ ID NO.3，DNA序列见SEQ ID NO.4。同时，使用AlphaFold2预测了传统Mtu RecA内含肽与内含肽变体的蛋白三级结构，并进行了序列比对，发现突变前后的内含肽蛋白三级结构高度相似，内含肽活性中心并没有受到影响，仍保持原有的内含肽结构。
[0025]实施例2内含肽Mtu RecA突变体和谷胱甘肽GSH融合蛋白原核表达载体的构建
[0026]传统内含肽Mtu RecA和谷胱甘肽GSH融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.5，其DNA序列见SEQ ID NO.6。内含肽Mtu RecA突变体和谷胱甘肽GSH融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.7，其DNA序列见SEQ ID NO.8。基因序列合成于南京金斯瑞生物科技有限责任公司，5
’
端酶切位点选用BamH I，3
’
端酶切位点选用Xho I。1ug合成后的质粒和pET28a经BamH I和XhoI双酶切反应切割后，2％琼脂糖凝胶回收相应大小的片段。再使用T4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内含肽Mtu RecA突变体，其特征在于其序列如SEQ ID No.3所示。2.权利要求1所述的内含肽Mtu RecA突变体的编码DNA，其特征在于：a)序列表中SEQ ID No.4所示的DNA序列；b)编码序列表中SEQ ID No.3蛋白质序列的多核苷酸序列。3.权利要求1所述的内含肽Mtu RecA突变体在生产谷胱甘肽GSH中的应用。4.一种内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白，其特征在于序列如SEQ ID No.7所示。5.权利要求4所述的内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH融合蛋白的编码DNA，其特征在于：a)序列表中SEQ ID No.8所示的DNA序列；b)编码序列表中SEQ ID No.7蛋白质序列的多核苷酸序列。6.一种pET28a
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内含肽Mtu RecA突变体
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谷胱甘肽GSH表达质粒，其特征在于表达权利要求4所述的内含肽Mtu Re...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗元廷，张志乾，王嘉鹏，王海梅，吴奕瑞，刘丽花，江翱，胡玉成，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：