修饰型转谷氨酰胺酶制造技术

本发明专利技术所要解决的技术问题在于，发现对转谷氨酰胺酶的改良有效的新突变，提供一种有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶。本发明专利技术公开了一种实施了氨基酸替换的有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶，所述氨基酸替换带来了高温反应性的提高或弱酸性区的pH稳定性下降的氨基酸替换的。高或弱酸性区的pH稳定性下降的氨基酸替换的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰型转谷氨酰胺酶


[0001]本专利技术涉及转谷氨酰胺酶。详细而言，涉及一种特性发生了改变或得到提高的修饰型转谷氨酰胺酶及其用途等。

技术介绍

[0002]转谷氨酰胺酶为一种催化肽链内的谷氨酰胺残基的γ
‑
羧酰胺基的酰基转移反应的酶，当蛋白质中的赖氨酸残基的ε
‑
氨基作为酰基受体起作用时，在蛋白质分子的分子内或分子间形成ε
‑
(γ
‑
Gln)
‑
Lys交联键。因此，利用转谷氨酰胺酶的作用可进行蛋白质或肽的改性，因此将来自链霉菌属的转谷氨酰胺酶(例如参照专利文献1)用于肉的粘合、香肠、豆腐、面包、面条类的制造。另外，除食品领域以外，转谷氨酰胺酶在纤维领域、医疗领域、香氛化妆品领域等中的应用也在研究之中。随着这样的应用扩展，正在尝试改良转谷氨酰胺酶的特性(耐热性、比活性、底物特异性、稳定性等)(例如参照专利文献2～4、非专利文献1～4)。现有技术文献专利文献
[0003]专利文献1：日本特开平4
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108381号公报专利文献2：日本特开2002
‑
253272号公报专利文献3：日本特开2008
‑
194004号公报专利文献4：国际公开第2019/107288号小册子非专利文献
[0004]非专利文献1：Marx CK et al.,J.Biotechnol.2008年9月10日；136(3
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4)：156
‑
62.非专利文献2：Tagami U et al.,Protein Eng.Des.Sel.2009年12月；22(12)：747
‑
752.非专利文献3：Yokoyama K et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2010)87：2087
‑
2096.非专利文献4：Buettner K et al.,Amino Acids.2012年2月；42(2
‑
3)：987
‑
96.

技术实现思路

专利技术所要解决的技术问题
[0005]如上所述，现有技术中，为了提高耐热性、比活性等而尝试了改良转谷氨酰胺酶，但是从其有用性更高、用途的进一步扩展等理由出发，改良转谷氨酰胺酶的需求依然较高。因此，本专利技术所要解决的技术问题在于，发现对改良转谷氨酰胺酶有效的新突变，提供一种有用性高的修饰型转谷氨酰胺酶(突变体)及其用途等。用于解决技术问题的技术方案
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的专利技术人尝试了通过氨基酸替换(将特定的氨基
酸残基变换为其它氨基酸)来改良来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶。反复试错的结果，成功地鉴别出对改变其特性(高温反应性提高、弱酸性区的pH稳定性降低)有效的多个突变(氨基酸残基与替换后的氨基酸的组合)。
[0007]另外，鉴于同种酶的结构(一级结构、立体结构)相似性高、同样的突变产生同样的效果的概率高这一技术常识，将在具有序列号1的氨基酸序列的来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶中发现的有用的突变应用于与该转谷氨酰胺酶之间的结构相似性高的其它的转谷氨酰胺酶时，发挥同等效果的概率高，并且本领域技术人员能够认识到，这样的应用是有效的。
[0008]以下专利技术基于以上的成果及考察而作出。[1]一种修饰型转谷氨酰胺酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含以下(1)～(11)中的任一氨基酸替换的氨基酸序列、或具有与该氨基酸序列表现出80％以上的一致性的氨基酸序列(但是，氨基酸序列的差异产生在所述氨基酸替换的位置以外的部分)，并且可观察到与所述氨基酸替换对应的特性变化：(1)突变点为Y34和F305，突变点Y34的替换后的氨基酸为W，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(2)突变点为M288，替换后的氨基酸为L、F或Y，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(3)突变点为D3，替换后的氨基酸为W或K，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(4)突变点为D3和F305，突变点D3的替换后的氨基酸为G、K、N、P或W，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(5)突变点为V65和F305，突变点V65的替换后的氨基酸为I，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(6)突变点为S303和F305，突变点S303的替换后的氨基酸为R或K，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(7)突变点为R5，替换后的氨基酸为H，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(8)突变点为V6，替换后的氨基酸为D，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(9)突变点为W59，替换后的氨基酸为T，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(10)突变点为S61，替换后的氨基酸为G或R，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(11)突变点为V290，替换后的氨基酸为I，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降。[2]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述一致性为82％以上。[3]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述一致性为85％以上。[4]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其中，所述一致性为90％以上。[5]根据[1]所述的修饰型转谷氨酰胺酶，其包含序列号2～22中任意的氨基酸序
列。[6]一种基因，其编码[1]～[5]中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。[7]根据[6]所述的基因，其包含序列号23～43中任意的碱基序列。[8]一种重组DNA，其包含[6]或[7]所述的基因。[9]一种微生物，其携带[8]所述的重组DNA。[10]一种酶制剂，其包含[1]～[5]中任一项所述的修饰型转谷氨酰胺酶。[11]一种修饰型转谷氨酰胺酶的制备方法，其包括以下的步骤(I)～(III)：(I)准备编码[1]～[5]中任一项的修饰型转谷氨酰胺酶的氨基酸序列的核酸的步骤；(II)使上述核酸表达的步骤、及(III)回收表达产物的步骤。[12]根据[11]所述的制备方法，其中，所述氨基酸序列为序列号2～22中任意的氨基酸序列。[13]根据[12]所述的制备方法，其中，所述核酸包含序列号23～43中任意的碱基序列。
具体实施方式
[0009]为了便于说明，以下对本专利技术所使用的术语的一部分进行定义。(术语)术语“修饰型转谷氨酰胺酶”是指：对成为基准的转谷氨酰胺酶(以下称为“基准转谷氨酰胺酶”)进行修饰或使其突变而得到的酶。基准转谷氨酰胺酶典型地为具有序列号1的氨基酸序列的来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的转谷氨酰胺酶。
[0010]术语“来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶”是指其来源为茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶，包括茂原链霉菌所产生的转谷氨酰胺酶或利用该转谷氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰型转谷氨酰胺酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含以下(1)～(11)中的任一氨基酸替换的氨基酸序列，或具有与该氨基酸序列表现出80％以上的一致性、且差异产生在所述氨基酸替换的位置以外的部分的氨基酸序列；并且能够确认到与所述氨基酸替换相对应的特性变化：(1)突变点为Y34和F305，突变点Y34的替换后的氨基酸为W，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(2)突变点为M288，替换后的氨基酸为L、F或Y，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(3)突变点为D3，替换后的氨基酸为W或K，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(4)突变点为D3和F305，突变点D3的替换后的氨基酸为G、K、N、P或W，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(5)突变点为V65和F305，突变点V65的替换后的氨基酸为I，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(6)突变点为S303和F305，突变点S303的替换后的氨基酸为R或K，突变点F305的替换后的氨基酸为W，氨基酸替换所带来的特性变化为高温反应性提高；(7)突变点为R5，替换后的氨基酸为H，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(8)突变点为V6，替换后的氨基酸为D，氨基酸替换所带来的特性变化为弱酸性区的pH稳定性下降；(9)突变点为W59，替换后的氨基酸为T，氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田和典，
申请(专利权)人：天野酶制品株式会社，
类型：发明
国别省市：